双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌凋亡调控基因表达的影响

　　中国微生态学杂志1999年第11卷第4期

王立生　潘令嘉　郑跃杰　施　理　吕爱民　张亚历　周殿元

　　摘　要　为探讨双歧杆菌的完整肽聚糖的抑瘤途径及机制，本文以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，采用免疫组化SP法检测了40只裸鼠移植瘤bcl-2及bax基因的蛋白表达率及表达强度。结果显示完整肽聚糖注射组大肠癌移植瘤bcl-2蛋白表达率及阳性细胞密度均低于肿瘤对照组，bax基因的表达情况则相反。提示双歧杆菌的完整肽聚糖可使大肠癌裸鼠移植瘤的bcl-2基因表达下调，bax基因表达增强，最终诱导肿瘤细胞凋亡，实现其抗瘤目的。

　　关键词：双歧杆菌　完整肽聚糖　大肠癌　凋亡

　　双歧杆菌系机体肠道内数量最多，功能最重要的生理性细菌，它具有营养免疫，生物学屏障，抗衰老、防辐射、维持肠道微生态平衡等生理功能。完整肽聚糖(Whole peptidoglycan,WPG)是双歧杆菌细胞壁中的最主要成份，它保持了全菌的一些重要生物学特性。目前研究表明，它和OK-432、BCG及短小棒状杆菌等微生物制剂一样，在体内能抑制多种肿瘤的发生与发展^［1］。我们也证实分叉双歧杆菌的WPG能诱导大肠癌细胞的凋亡，对大肠癌裸鼠移植瘤的生长具有一定的阻抑作用。本文以免疫组化法检测了分叉双歧杆菌的WPG对大肠癌裸鼠移植瘤bax及bcl-2基因蛋白表达水平的影响，旨在探讨它的抑瘤途径及机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　WPG　按Sekine等报道的方法从分叉双歧杆菌中提取而成，并经过鉴定^［2］。由重庆医科大学胡宏教授馈赠。

　　1.2　实验动物　BALB/c(nu/nu)，5周龄～8周龄，雄性，体重约18g～23g，购自本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。

　　1.3　大肠癌细胞株　Lovo细胞为人末分化结肠癌细胞，引自本校病理教研室。实验时按常规传代于含10%小牛血清的RPMI1640培养液内，待长至单层后，以0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，收集并调细胞数为1×10⁷/ml。

　　1.4　大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及WPG的抑瘤试验　实验分为二组：(1)肿瘤对照组：20只裸鼠，实验的第1天于裸鼠左前肢背部皮下注射Lovo细胞2×10⁶/ml(0.2ml)，第2天起向其腹腔注射PBS液0.2ml，每天一次，连续5天；(2)WPG注射组：20只裸小鼠，实验第1天接种Lovo细胞的数量、部位以及程序均同肿瘤对照组，不同之处是实验的第2天起于裸鼠腹腔注射WPG0.25mg(相当于1×10⁹个分叉双歧杆菌)，每天一次，连续5天。于实验的第21天处死荷瘤鼠，剥离瘤体，以10%中性福尔马林固定新鲜瘤组织，常规石蜡包埋，连续切片，厚约4μm，选取一张行HE染色，组织学证实为未分化结肠癌。

　　1.5　免疫组化染色　操作程序按免疫组化SP法进行。鼠抗人bcl-2单抗及鼠抗人bax单抗，生物素化马抗鼠IgG以及链霉亲和素过氧化物酶均为Santa Cruz公司产品。以PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判断：bcl-2及bax阳性细胞均表现为胞浆棕黄色。阳性细胞密度计数时以D16目镜测微网于放大400倍下计算网格内的阳性细胞总数，共观察10网格，取其平均值作为该样本的阳性细胞密度。表达强度按细胞着色有无以及强弱程度划分为：阴性(-)，弱阳性(+)，中等强度阳性(++)，强阳性(+++)。

　　1.6　统计学处理　两组之间阳性细胞密度之间的比较采用t检验；两组之间着色强度之间的对比采用秩和检验。

　　2　结　果

　　2.1　WPG对大肠癌裸鼠移植瘤bcl-2基因蛋白表达水平的影响　实验结果显示，bcl-2蛋白阳性表达产物呈棕黄色，位于胞浆。WPG注射组移植瘤bcl-2蛋白阳性表达率为65%，主要为弱阳性表达，阳性细胞成簇或弥漫分布。肿瘤对照组bcl-2蛋白的阳性表达率为90%，主要是中等及强阳性表达，阳性细胞弥漫分布(图1)。比较两组间的bcl-2阳性细胞密度，发现肿瘤对照组显著高于WPG注射组(P＜0.01)。具体见表1，2。

图1

表1　WPG对大肠癌裸鼠移植瘤bco-2及bax基因蛋白表达强度及表达率的影响

注：与WPG注射组比较，^*P＜0.05；与肿瘤对照比较，^**P＜0.01。

表2　肿瘤对照组及WPG注射组大肠癌移植瘤bcp-2及bax阳性细胞密度(个)

注：与WPG注射组比较，^ΔP＜0.05；与肿瘤对照比较，^ΔΔP＜0.01。

　　2.2　WPG对大肠癌裸鼠移植瘤bax基因蛋白表达水平的影响　bax蛋白阳性产物位于瘤细胞的胞浆，呈棕黄色，背景清晰。bax基因在WPG注射组移植瘤中的表达情况和bcl-2基因相反，阳性表达率为95%，主要呈强阳性表达(图2)。在肿瘤对照组中其阳性表达率为40%，主要呈弱阳性表达，此外两组之间bax阳性细胞密度亦有明显差异，WPG注射组显著高于肿瘤对照组(P＜0.01)。具体见表1，2。

图2

　　3　讨　论

　　双歧杆菌的WPG是一种多糖与肽聚糖聚合而成的袋状结构。它保持了细菌细胞壁的完整性，具有免疫赋活、抗衰老以及抗突变等多种重要生理功能^［3］。此外它在体内还能抑制多种肿瘤的发生与发展。Sekine等证实婴儿型双歧杆菌的WPG能明显抑制小鼠皮下移植的Meth A纤维肉瘤的发生与发展^［1］。我们也发现分叉双歧杆菌的WPG对裸鼠皮下移植的大肠癌的生长具有明显的阻抑作用，并通过透射电镜以及原位末端标记等手段和方法证实它能诱导大肠癌移植瘤细胞的凋亡。

　　细胞凋亡是有核细胞在基因调控下发生的一种细胞的主动死亡方式。已知bcl-2基因家族是重要的凋亡调控基因。bcl-2可通过细胞内抗氧化作用以及抑制Ca²⁺离子跨膜运动等途径来抑制多种因素诱发的细胞凋亡，最终延长细胞的寿命，而非刺激细胞增殖^［4］。bax基因是bcl-2基因家族中的新成员，它和bcl-2基因具有40%的同源性，但生理作用却相反。当bax大量表达时，它本身可以形成多量的bax-bax同二聚体，亦可和bcl-2结合形成异二聚体，最终诱导细胞进入程序化死亡^［5］。本文结果中，肿瘤对照组大肠癌移植瘤主要以bcl-2表达为主，而荷瘤鼠经腹腔注射分叉双歧杆菌的WPG后，大肠癌移植瘤的bcl-2基因表达程度显著减弱，而bax基因的表达显著增强，提示分叉双歧杆菌的WPG能显著增强大肠癌移植瘤bax基因的蛋白表达水平，同时使bcl-2基因的表达下调。

　　目前认为WPG的抑瘤机制主要是通过激活机体免疫系统中的巨噬细胞、NK细胞以及B淋巴细胞等免疫效应细胞，使之分泌多量的具有杀瘤活性的细胞毒性效应分子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ、NO以及多种抗体等^［6］。结合本文实验结果，我们认为WPG的另一抑瘤途径是通过调控肿瘤细胞的凋亡相关基因的表达，即增强bax基因的表达，增加bax/bcl-2的比例，最终诱导它的凋亡。

　　作者单位：第一军医大学南方医院全军消化内科研究所　广州　510515

　　参考文献

　　［1］Sekine K,Toida T,Saito M,et al.A new morphologically characterized cell wall preparation (whole peptidoglycan)from bifidobacterium infantis with a high efficacy on the regression of an established tumor in mice.Cancer Res.1985;45:1300-1307

　　［2］乐军，胡宏.双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离与纯化.中国微生态学杂志.1997；9：10-13

　　［3］王立生，潘令嘉，周殿元.双歧杆菌抗肿瘤作用的研究进展.国外医学肿瘤学分册.1998；25：11-12

　　［4］Hockenbery D,Nunez G,MillimanC,et al.Bcl-2 as an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death.Nature.1990;384:334-338

　　［5］Oltval AN,Melliman Cl,Korsmeyer SJ,et al.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programed cell death.Cell.1993;74:609-619

　　［6］Sekine K,Ohta J,Onishi M,et al. Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull.1995;18:148-153