大肠癌组织p16蛋白的表达及其意义

　　第四军医大学学报1999年第20卷第7期

　　黄玉新　吴金生　赖大年　马庆久　王青

　　摘　要　目的:研究抑癌基因p16与大肠癌发生发展的关系.方法:采用免疫组织化学ABC法检测了31例结肠癌，22例直肠癌，28例正常大肠组织中抑癌基因p16的表达情况.结果:正常大肠组织和大肠癌组织中p16蛋白的阳性率分别为75%(21/28)和35.7%(19/53，P＜0.01);p16蛋白表达随着肿瘤组织分化程度降低而减弱，阳性表达率有显著性差异(P＜0.05).结论: p16蛋白表达缺失与肿瘤分化不良有关 ( r=-0.3383，P＜0.05)，有助于判断肿瘤分化程度及估计预后.

　　关键词:结肠直肠肿瘤　p16蛋白　肿瘤基因　免疫组织化学

　　0　引言

　　近年来有关抑癌基因p16的研究引起国内外学者的高度重视,发现约50%的恶性肿瘤有p16突变与缺失^［1］. 有关免疫组织化学法检测大肠癌组织p16基因的表达目前国内少见报道^［2］.我们应用免疫组织化学ABC法检测了53例大肠癌组织中p16基因表达情况，并用28例正常大肠组织对照研究，现将结果报告如下.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　收集本校唐都医院病理科1992～1994年大肠癌手术切除蜡块标本53例,均经100 mL/L中性福尔马林液固定,常规石蜡包埋后存档,所有标本均做5μm连续切片2张,1张HE染色复查诊断,另1张免疫组化研究.取距肿块15 cm以上的正常组织标本28例作为对照. 53例大肠癌中男32例,女21例,年龄32岁～80岁,平均52.1岁,其中结肠癌31例,直肠癌22例. dukes分期5/A，28/B，15/C，5/D. 分化程度:高中分化腺癌20例，低分化腺癌26例，粘液癌5例，末分化癌2例. aBC试剂盒及兔抗p16多克隆抗体，DAB显色试剂，第2抗体(羊抗兔抗体IgG)购自北京中山生物技术公司.

　　1.2　方法　免疫组化染色采用ABC法，主要步骤如下:切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗5 min，微波修复抗原10 min，30 mL/L H₂ O₂ /PBS 5 min灭活内源性酶，PBS洗5 min，滴加抗原修复液室温10 min，PBS洗5 min，小牛血清(封闭)覆盖，置37℃烤箱30 min，弃去上液，滤纸吸干，滴加一抗(兔抗p16多克隆抗体1∶50)，4℃过夜，PBS洗5 min，滴加生物素化羊抗兔抗体IgG，37℃孵育15 min，PBS洗5 min，加ABC复合物室温作用15 min，PBS洗5 min，DAB液显色5 min～10 min，自来水冲洗，苏木精复染30 s，PBS浸泡至切片变蓝，自来水冲洗，950 mL/L乙醇，二甲苯分别固定封片，显微镜下观察.以正常兔血清代替一抗作为阴性对照，并设乳腺癌阳性染色为阳性对照.阳性标准: 以细胞呈清晰棕色为阳性.按阳性细胞所占比例分为阳性(+)，阳性细胞＜50%，强阳性(++)，阳性细胞＞50%或为棕褐色，以细胞无棕色或与背景一致浅黄色为阴性(-).

　　检测结果采用χ²检验进行统计分析，检验标准取P＜0.05为显著意义.

　　2 　结果

　　2.1　大肠癌组织和正常大肠组织p16蛋白表达　p16在大肠癌组织中总阳性表达率为35.85%，明显低于正常大肠组织，二者相比差异有显著意义(P＜0.01)，在结肠癌与直肠癌组织中表达差异无显著意义(Tab1).

表 1　p16蛋白阳性表达及强度

　　tab 1　Positive expression and intensity of p16 protein

　　^aP＜0.01 vs normal colorectal.

　　2.2　p16蛋白的表达与大肠癌组织分化程度的关系　p16蛋白的表达与大肠癌分化程度明显相关,随组织分化程度的降低表达阳性率明显下降,即低分化腺癌表达明显低于高中分化腺癌,差异有显著意义(P＜0.05),5例粘液癌及2例未分化癌中无一例表达,差异有极显著意义(P＜0.01，Tab2).

表 2　大肠癌p16表达与分化程度及组织类型关系

　　tab 2　Relationship between p16 expression and malignant degree and histological type of colorectal cancer

　　^aP＜0.05 vs low malignant adenocareinoma.

　　3　讨论

　　p16基因是1995年美国分子遗传学家分离的一种新的肿瘤抑制基因^［1］，又因对多种肿瘤起抑制作用而被称为多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor gene 1 MTS1)它定位于人染色体9P₂₁区位，其完整编码序列包括2个内含子和3个外显子，其中5′端126 bp区域为外显子1，中间307bp为外显子2，3′端11 bp为外显子^［3］，外显子序列编码为一种已知的细胞周期素依赖性激酶(cyclinin-dependent kinase CDK)的抑制蛋白p16，全长8.5 kb，氨基酸序列分析表明，成熟的p16分子为15.8 ku的单链多肽，含有一个有148个氨基酸的开放阅读框架，由307个氨基酸组成^［4］. p16基因在众多人类肿瘤细胞系有纯合性缺失，体外研究发现，来源于人肺、乳腺、食管、结肠、膀胱、卵巢等部位的癌细胞株均有高频率的p16基因缺失，据统计达75%^［5］.超过了p53基因50%的突变率^［6］ ，这一事实提示p16基因在肿瘤发生过程中扮演着重要角色.

　　真核细胞的分裂必须经过两个关键环节:G1→S期和G2→M期.CDK是细胞周期调节中心，目前发现至少有5种CDK与G1→S期的调节有关，它能直接控制细胞周期素(cyclin)，有证据表明cyclin D1表现癌基因的作用，当其表达过度时，细胞会向癌变发展. p16的抑癌与细胞周期调节密切相关^［7］，它是细胞周期的一种负性调控因子，可与cyclin D竞争结合细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)，当p16与CDK4结合时，阻止细胞生长分裂^［5］.当cyclin D 与CDK4 结合时通过调节多种重要底物RB基因(视网膜母细胞瘤抑癌基因)的磷酸化，打开 G1→S 期, G2→M 期的转换开关^［8,9］，从而刺激细胞增殖. 若没有p16蛋白的抑制作用，一方面不能竞争结合CKD4阻止细胞分裂，另一方面增加cyclin d同CDK4结合，细胞会异常增生，旺盛分裂，最终失去控制，这可能是肿瘤发生的主要原因之一^［10］.

　　本结果表明，正常大肠组织和大肠癌组织中均可能有p16蛋白表达，但在大肠癌组织中表达率为35.8%明显低于正常大肠组织75.0%(P＜0.01)，表达强度也低于正常大肠组织，证明了p16蛋白缺失与大肠癌发生有关.还表明大肠癌组织p16基因表达率与肿瘤恶性程度呈负相关(r=-0.3383,P＜0.05).随着肿瘤恶性程度的增高，分化程度的降低，p16蛋白阳性表达率及强度明显下降(P＜0.05)，而在粘液癌及未分化癌组织中无一例阳性表达.直肠癌与结肠癌组织间表达率分别为35.8%和31.8%，二者差异无显著意义.提示p16蛋白缺失与大肠癌分化不良有关，可作为临床判断肿瘤分化程度、估计预后的一个参考指标.

　　综上所述，推测p16蛋白的缺失可能广泛存在于大肠恶性肿瘤中，并与肿瘤的发生发展及恶性行为密切相关，这与国内的研究相符.因此p16蛋白的存在可能阻止大肠恶性肿瘤的发生，反之，p16蛋白缺失，细胞则异常增生和恶性转化，所以，加深对p16蛋白生物化学作用的了解，有助于阐明大肠癌变的分子生物学基础，为进一步研究和探讨大肠癌的发病机理研究提供新的思路.作者简介:黄玉新,男,1956-02-17生,陕西省镇安县人,汉族.1984年新疆医学院医疗系毕业,主治医师. 发表论文7篇, 96级基金班学员.现在海南省武警总队医院外科，　海口市 570203　电话:(0991)3716811-4068.

　　作者单位：第四军医大学唐都医院普通外科,陕西西安 710038

　　参考文献

　　1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994;264(12):436-440

　　2 游学科,卢放根,结肠癌组织中 p16和CDK4的表达及相互关系.湖南医学， 1997 ;14 (4): 195-196

　　3 Serrano M, Hannon GJ, Beach DA. New regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature,1993;366(16): 704-707

　　4 Bonettal. Open question on p16. Nature,1994;370(21):180

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　　6 吕肖勇,多基因变异与胃粘膜细胞癌变的关系.中华消化杂志,1996;16(1):9-13

　　7 Hannon GJ, Beach D. p^15INK4B is a potential effector of TGF-β-induced cell cycle arrest. Nature, 1994:371(15):257-261

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　　9 Matsushime H, Ewen ME, Strom DK et al. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (P34DSKOJ3 /CDK4) for mammallan D type G1 cyclins. cell,1992;71(2):323-334

　　10 Wadih A, Ryo N, Frank B et al. Replacement of the p16/CDKN2 gene suppresses human glioma cell Gorwth. Cancer Res, 1995;55(6):1351-1354