抑癌基因p53在胃癌组织的表达及临床意义^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第8期

宫立群　朱曰林　尹浩然　王瑞年　林言箴　张熙曾

　　摘　要　目的:探讨p53基因在胃癌的表达与临床、病理因素及预后的关系，探索p53基因异常表达在胃癌发生过程中的作用。方法:使用抗p53蛋白的单克隆抗体DO－7，对98例人胃癌组织p53的表达进行免疫组化研究。结果:48例胃癌组织p53基因表达阳性(49％)。p53基因表达与胃癌的大体类型、分化程度、生长方式、浸润深度、淋巴结转移等指标均无明显关系。在10例有不典型增生的癌旁组织中,2例呈阳性反应；在4例有肠上皮化生的癌旁组织中及其余正常的癌旁组织中均无阳性表达。根据有随访资料的55例统计结果，显示p53表达与胃癌预后无显著性相关(P＞0.05)。结论:p53基因的突变可能是胃癌发生发展过程中的早期事件。由于p53表达在胃癌组织有较高的阳性率，其测定可用于对高危人群的筛选。

　　 　　关键词：胃癌　免疫组织化学　p53基因

　　p53基因位于染色体17P13，全长约20Kb，由11个外显子组成，其蛋白产物是分子量为53KD的核磷酸蛋白，该蛋白在细胞周期中抑制细胞从G₀／G₁期进入到S期^[1]。1988年以前，p53一直被认为是细胞的原癌基因，近期的研究已证实野生型p53基因是一类重要的抑癌基因，其蛋白产物与DNA结合并抑制细胞的过度增殖和转化，对细胞生长具有负调节作用。

　　在正常细胞中，野生型p53蛋白的半衰期约15分钟，易被水解，因此细胞中含量极低，应用常规的免疫组化方法难以测出。当p53基因突变后，就会失去与DNA结合及抑制细胞增殖的能力，反而具有促进恶性转化的活性。此时p53蛋白的构型发生改变，与组织内各种病毒和细胞基因结合成稳定复合物，半衰期明显延长，在恶性肿瘤细胞中堆积增多，通过常规的免疫组织化学技术即可测得p53基因的过度表达。研究表明，p53肿瘤蛋白的表达具有广谱性，在消化道肿瘤、泌尿系肿瘤、胚胎性肿瘤以及软组织肿瘤的石蜡切片中均能检测出p53异常蛋白，并且与一些癌肿的分化程度及预后有一定关系^[2]。

　　本文运用目前认为最特异敏感的抗p53蛋白单克隆抗体DO－7，对98例人胃癌组织的p53的表达进行研究，其中55例有5年随访资料，目的在于探讨p53基因表达于各临床、病理因素及预后的关系，并探索p53基因异常表达在胃癌发生发展过程中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　组织材料及处理

　　98例胃癌组织取自瑞金医院1984～1991年期间手术切除标本。其中男性64例，女性34例，平均年龄60岁(33～80)岁。早期胃癌30例(30.6％)，进展期胃癌68例(69.4％)。98例标本中，4例可以观察到癌旁肠上皮化生，10例可以观察到癌旁不典型增生。在新鲜标本中摘取所有淋巴结后，分组固定。绘图并记录肿瘤部位、肿瘤大小、大体类型及浆膜受侵状况。将标本展平固定，于10％福尔马林溶液中浸泡48h。在肿瘤浸润最深处及癌旁多处取材。作常规石蜡包埋，HE染色。观察指标包括组织类型、分化程度、生长方式、浸润深度、切端状况、脉管癌栓、淋巴结转移及邻近脏器浸润等。最后确定TNM分期。

　　1.2　免疫组织化学染色

　　应用鼠抗人p53单克隆抗体DO－7(Novocastra)进行LSAB法免疫组化染色。DO－7能识别人类p53蛋白氨基端第35～45氨基酸残基，与野生型和突变型p53均发生反应，可用于冰冻和石蜡切片。抗体稀释度为1:5。抗体及LSAB试剂盒均购自上海华美生物技术公司。每次染色均采用对照抗体或空白抗体代替一抗作为阴性对照。每例切片均另作常规HE染色。

　　1.3　结果判断方法

　　对p53着色强度作以下规定:未见阳性肿瘤细胞者为(－);染色淡或阳性细胞＜26％者为（＋）；染色适中或阳性细胞占25％～50%者为（＋＋）；染色深或阳性细胞＞50％者为(＋＋＋)。

　　1.4　统计学处理

　　用χ²检验来判断各病理因素与p53反应的关系有无显著性。用寿命表法(Lifetablemethod)比较生存曲线，用Wilcoxontest进行各组生存率的显著性检验。所有统计处理均由BMDP软件包完成。

　　2　结果

　　p53阳性物质位于细胞核内，呈棕色细颗粒状。98例中，呈阳性反应者48例(49％)，其中4例癌旁肠上皮化生组织无阳性染色，而10例不典型增生癌旁组织中，有2例呈阳性(占20％)(图1，2)。细胞浆、细胞质和正常胃粘膜中均为阴性(图1，2)。早期胃癌30例中有14例呈阳性反应(47％)，进展期胃癌68例中有34例呈阳性反应(50％)，统计学上无显著差异。

图1　膨胀型生长胃癌p53染色

图2　侵袭型生长胃癌p53染色

　　p53反应与临床各病理因素之间的关系见表1，可见各病理因素与p53表达均无显著相关。

表1　p53基因表达与胃癌临床病理因素的关系

	例数	p53(＋)例(％)	P值
Borrmann分型
大体局限型	48	25(52.1)	＞0.05
大体浸润型	50	23(46.0)
分化程度
Ⅰ，Ⅱ级	44	22(50.0)	＞0.05
Ⅲ，Ⅳ级	54	26(48.1)
生长方式
膨胀型	39	22(56.4)	＞0.05
浸润型	59	26(44.1)
浸润深度
未累及浆膜	43	22(51.2)	＞0.05
累及浆膜	55	26(47.3)
淋巴结转移
无转移	37	16(43.2)	＞0.05
有转移	61	32(52.5)
TNM分期
Ⅰa，Ⅰb	30	14(46.7)
Ⅱ，Ⅲa	41	23(56.1)	＞0.05
Ⅲb，Ⅳ	27	11(40.7)
远处转移
无转移	90	44(48.9)	＞0.05
有转移	8	40(50.0)

　　98例胃癌病例有5年随访资料者55例。其中术后5年内因癌肿复发死亡者26例(47.3％);5年后存活者29例(52.7％)。55例中，p53表达阳性者30例，阴性者25例。p53表达阳性胃癌病例的近期死亡率和5年存活率与p53阴性病例相比，χ²检验无显著性差异(P＞0.05，表2)。5年内死亡组与5年后存活组的p53阳性表达率亦无显著性差异(P＞0.05)。再用Wicoxontest进行各组生存率的显著性检验也无统计学意义(P＞0.05)

表2　p53基因表达与胃癌预后的关系　例数(％)

随访	例数	p53
		阳性	阴性
5年内死亡	30	12(40.0)	18(60.0)
5年后存活	25	14(56.0)	11(44.0)
合计	55	26(47.4)	29(52.6)

　　3　讨论

　　本文应用DO－7鼠抗人p53单克隆抗体，对98例人胃癌组织的p53表达进行免疫组织化学分析，结果发现48例呈阳性染色(49％)，与p53基因在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和大肠癌组织中表达的阳性率相接近^[4～6]。但p53基因在胃癌中表达的阳性率，各家报道有所不同。Martin等^[7]应用p53多克隆体CM1，其阳性率为57％，Sasano^[8]用单克隆抗体PAB1801，阳性率为33％。结果不一致的原因可能与抗体的特性及所研究对象的不同有关。多数学者认为，p53表达与胃癌临床病理因素之间无明显相关^[8,9]。在本组资料中，p53阳性染色与胃癌的分化程度、生长方式、浸润深度、淋巴结转移之间均无显著相关，并且早期癌与进展期癌p53表达的阳性率也很相近。因此我们推测，p53基因的突变可能是胃癌发生发展过程中的早期事件。Shiao等^[10]用抗p53多克隆抗体CM1对12例人胃癌标本进行了免疫组织化学研究;在12例石蜡切片标本中，均同时有正常胃粘膜组织、上皮不典型增生和胃癌组织，其中8例同时含有肠上皮化生组织;结果上皮不典型增生和胃癌组织的p53阳性表达率均为60％，而在癌旁正常组织和肠上皮化生组织中未发现p53基因的表达;提示p53基因突变发生在癌前病变的较后期阶段。在本组98例胃癌标本中，48例肿瘤组织呈阳性(49％);4例癌旁肠上皮化生组织无阳性染色;10例不典型增生的癌旁组织中有2例呈阳性反应，占20％;而正常胃粘膜组织中均无阳性反应。以上结果支持了Shiao^[10]的观点。对大样本癌前病变进行p53基因表达的检测将有助于进一步了解p53基因在胃癌发生过程中的作用。至于p53基因表达与胃癌预后的关系，迄今尚无一致结论。Martin等^[7]发现p53蛋白阳性的病例，平均5年生存率为13个月，而p53阴性者为102个月，二者之间差异显著。Sasano等^[8]则报道p53基因的表达与胃癌患者的预后无关。本文统计结果也显示p53表达与胃癌的预后无显著相关性。由于目前对突变的p53基因究竟如何影响到肿瘤细胞的生长和分化还了解甚少，所以还不能充分解释上述结论不一致的原因。此外，免疫组化的方法虽然能检测出绝大多数基因的突变情况，但是在一些特殊情况下，仍难免出现假阴性和假阳性结果。在这种情况下，同时采用分子生物学和免疫组化两种方法进行对照研究，将有助于得出更确切的结论。

　　＊本文课题受上海市高教局重点学科基金资助

　　作者单位：宫立群　张熙曾　天津医科大学附属肿瘤医院胸科（天津市　300060）

　　 朱曰林　上海铁路局中心医院普外科

　　 尹浩然　王瑞年　林言箴　上海第二医科大学附属瑞金医院外科

　　作者单位：天津医科大学附属肿瘤医院胸科(天津市　300060)

参考文献

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　　2　Sun XF，Carstensen JM， Zhang H，et al. Prognostic significance of cytoplasmic p53 oncoprotein in colorectal adenocarcinoma. Lancet，1992;340:1369

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　　4　Marks JR，Devid AM，Kerus BJ，et al. Overexpression and mutation of p53 in epithelial ovarian cancer. Cancer Res，1991;51:2979

　　5　Seot1 N，Sager P，Stewart J，et al.p53 in colorectal cancer:clinical pathological correlation and prognostic significance. Br J Cancer，1991;63:317

　　6　Ostrowski JL，Sawan A，Henry L，et al. p53 expression in human breast cancer related to survival and prognostic factors:an immuno－ histochemical study. J Pathol,1991;164:75

　　7　Martin M,Filipe M,Richard W,et al. p53 expression and prog nosis in gastric carcinoma. Int J Cancer,1992;50:859

　　8　Sasano H,Date F, Imatani A,et al. Double immunostaining for c－crbB－2 and p53 in human stomach cancer cells. Human Pathol,1993;24:584

　　9　Uchino S,Noguchi M,Hirota T,et al. High incidence of nuclear accumulation of p53 protein in gastric cancer. Jpn J Clin Oncol,1992; 22: 225

　　10　Shiao YH,Rugge M, Correa P,et al. p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol,1994;144:511