大蒜油诱导人胃癌细胞分化和凋亡的机制研究

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中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷基础研究

作者：李晓光　谢锦玉　李文梅　赵敏　崔建涛　吕有勇

单位：100077 北京，中国康复研究中心细胞分子生物学研究室(李晓光)；中国中医研究院基础理论研究所(谢锦玉)；北京医科大学肿瘤学院分子生物学研究室［吕有勇(指导者)、李文梅、赵敏、崔建涛］

　　关键词： 大蒜油　　胃肿瘤　　细胞分化　　细胞凋亡

　　【摘要】　目的　从细胞和基因水平阐明大蒜油对人胃癌BGC-823细胞的作用机理。方法　用激光扫描共聚焦显微镜及Northern杂交等技术进行分析。结果　大蒜油对癌细胞形态、增殖和致瘤性有明显影响。结论　大蒜油通过促进p53、p21等的表达，诱导肿瘤细胞分化，同时诱导肿瘤细胞凋亡。

　　Garlic oil induces differentiation and apoptosis of human gastric cancer cell line　　Li Xiaoguang, Xie Jinyu, Li Wenmei, et al. China Rehabilitation Research Center, Beijing 100077

　　【Abstract】　Objectives　To study the mechanism of garlic oil-induced differentiation of human gastric cancer cell line BGC-823. Methods　Confocal microscopic assay and Northern blot hybridization were used to detect morphologioal change and gene expression in garlic oil treated human gastric cancer cells (BGC823). ResultsCell growth in vitro and tumorigenicity in nude mice were inhibited dramatically by garlic oil. Garlic oil treatment resulted in cell apoptosis as shown by DNA fragmentation. High expression level of WAF1/p21 and wild type p53 gene was detected in garlic oil-treated cells. Conclusion　These data indicate that differentiation and apoptosis of BGC-823 cell can be induced with garlic oil, and p21 and p53 genes possibly play important role in the process.

　　【Subject words】　Garlic oil　　Stomach neoplasms　　Cell diffrentiation　　Apoptosis

　　大蒜在我国民间药用已有三千多年的历史。在《本草纲目》中就有其药用价值的精辟记载^［1］。现代基础研究和临床实验证明, 大蒜有良好的防癌、抑癌作用^［2］。我国胃癌高低发区的流行病学资料表明,食用大蒜地区人群中的胃癌发病率，比全国平均水平低6倍,比高发区低10倍^［3］。我们在以往的实验研究中观察到，大蒜油对多种肿瘤细胞有十分明显的杀伤和增殖抑制作用。在此基础上，我们用激光扫描共聚焦显微镜，观察大蒜油处理后肿瘤细胞断层扫描、三维结构等的变化，分析大蒜油对肿瘤细胞基因表达的影响，以了解其抗肿瘤的作用机理。

材料与方法

　　1.实验药品：大蒜油，中医研究院基础理论研究所研制。取大蒜油1 g,吐温80 2 g和生理盐水100 ml制成10 g/L大蒜油乳剂,4℃冰箱保存。给药剂量为50 mg/L。对照组用DMEM培养液、生理盐水和20 g/L吐温80溶液。

　　2.细胞培养及细胞形态学观察：人胃癌BGC-823细胞用含10 ml/L小牛血清DMEM培养基,在37℃，5% CO₂条件下培养。细胞培养至80%融合时,更换培养基并加药,处理7天后释放药物,进行实验，并用光学显微镜观察。同时,收集脱壁细胞进行实验观察。

　　3.激光扫描共聚焦显微镜观察：用激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian公司)，以数值孔镜为1.3的100倍油镜观察。激光输出谱线488 nm蓝光,输出功率5 mW。AO双染(吖啶橙)^［4］，绿色荧光通过530/30、红色荧光通过583/20带通滤光片探测,Z轴方向由细胞顶部至底部0.6 μm步进式“切片”,对人胃癌BGC-823细胞进行断层共聚焦扫描成像。采集的共聚焦图像经InSIFHT专业图像板图处理,用InSIGHT计算机IQ软件做三维重建。

　　4.裸鼠致瘤性分析：Balb/c裸鼠,雌性,5周龄,9只。生长状态良好的细胞以胰酶消化,计数。培养基洗涤2次后用0.1 ml无血清培养基悬浮。裸鼠双侧背部皮下注射5×10⁵细胞,左侧注射待测细胞,右侧注射人胃癌BGC-823细胞作对照。连续观察肿瘤出现的时间和体积。

　　5. Northern杂交分析：大蒜油处理的人胃癌BGC-823细胞,采用酸性酚－异硫氰酸胍法提取细胞总RNA。细胞以Solution D(含4 mol/L异硫氰酸胍,50 mmol/L Tris， pH 7.6,10 mol/L EDTA, 20 g/l肉桂酸,0.1 mol/L 2-巯基乙醇)裂解,经酸性酚、氯仿/异戊醇抽提后,异丙醇沉淀,再溶于适量RNA Denaturing Buf中,酸性酚以0.2 mol/L NaOAc, 0.1 mmol/L ATA (aurint ricarboxylic acid,金精三羧酸),pH 4.0饱和^［5］。总RNA经12 g/L琼脂糖凝胶电泳分离,用毛细法将分离后的RNA由凝胶转移至尼龙膜上。缺口翻译或随机引物标记并纯化p53,p21cDNA探针,42℃旋转杂交24或48小时，洗膜后晾干,-70℃ X光曝光3～14天。

　　6.细胞总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳：将培养瓶中的上清离心,收集脱壁细胞,并提取细胞DNA。细胞总DNA提取按标准程序进行^［6］，DNA样品用紫外分光光度计定量。1.5% 琼脂糖凝胶电泳。

结果

　　1.大蒜油抑制癌细胞的生长和促分化作用：

　　(1)经大蒜油处理后人胃癌BGC-823细胞的形态变化:经50 mg/L大蒜油处理48小时后，即可显著抑制BGC-823细胞的生长。在光学显微镜下观察，可见细胞形态发生明显变化：细胞变得较平坦,呈多角形,核/质比例降低,细胞间隙不像癌细胞那样界限分明,而是近似正常细胞，间隙不明显。而全部对照组细胞，各个时间观察,细胞形态均无明显改变。

　　(2)激光扫描共聚焦显微镜三维图像分析大蒜油处理后的细胞变化: ①对照组BGC-823细胞光切片断层扫描观察:图1a为对照组细胞，中间的核显黄绿色荧光，为DNA；周围的胞质显示红色荧光，为RNA。细胞整体呈多角形,核大而圆。图1b为用药2周后,细胞形态发生明显变化,核/质比例降低。②大蒜油对BGC-823细胞DNA结构的作用:图2a为三维重建显示DNA荧光强度分布的立体图像,形似一个完整的蛋糕形,其顶部荧光强,相当于核中央,底部弱,相当于核周边。反映出从橙红→黄→浅青→蓝色不同颜色,右侧有颜色标尺说明荧光强度变化。图2b显示在三维重建DNA荧光强度分布图上，细胞核DNA缺损,荧光变弱。

　　2.大蒜油对BGC-823细胞裸鼠致瘤性的抑制作用：裸鼠致瘤实验结果显示，接种经大蒜油处理的细胞，4周内全部无肿瘤形成，而对照组2周内全部有肿瘤形成(图3)。

图3　GO处理BGC-823细胞的裸鼠致瘤性分析。左侧接种经GO处理的细胞，右侧接种对照组细胞

　　3.大蒜油诱导肿瘤细胞凋亡的作用：用50 mg/L处理BGC-823细胞6小时,可见清晰的DNA“梯型”(ladder)，而对照组细胞不显示“梯型”状DNA带纹；100 mg/L时,细胞出现弥散DNA带纹(图4)。　　

　　1：对照； 2：0.2 mg/L CAM； 3：5 mg/L；

　　4：25 mg/L； 5：50 mg/L； 6：100 mg/L

　　图4　细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳

　　4.大蒜油对肿瘤相关基因表达的影响：BGC-823细胞用50 mg/L大蒜油处理2周后，与未处理的对照组比较,表现出p53(图5)和p21(图6)基因表达增强。

　　1：100 mg/L；2：50 mg/L；3：空白对照

　　图5　GO处理BGC-823细胞的p53基因Northern杂交分析1：100 mg/L；2：50 mg/L；3：空白对照

　　图6　GO处理BGC-823细胞的p21基因Northern杂交分析

讨论

　　大蒜油是大蒜的主要有效成分。大量的药理实验证明,大蒜油具有较强的抗癌作用。使用大蒜油100 mg/Kg体重腹腔局部注射，可完全抑制U14和S180癌细胞的有丝分裂,使大部分癌细胞在形态上发生核碎裂、核固缩、细胞质空泡化等肿瘤细胞的退行性变化^［7］。为进一步阐明大蒜防治肿瘤的作用机理,我们从细胞和基因水平上分析了大蒜油对体外培养的人胃癌细胞的影响。

　　结果表明，50 mg/L大蒜油可明显抑制癌细胞生长,细胞形态结构发生类似正常细胞的显著变化,而且停止使用该药1周后，仍可继续保持其稳定的表型。将经大蒜油诱导分化的细胞进行裸鼠致瘤性分析,结果该细胞的致瘤性全部消失。说明大蒜油对癌细胞的作用是一种促分化效应而非细胞毒效应。细胞分化是指同一来源的细胞通过分裂逐渐产生结构和功能上稳定性差异的过程。现代医学认为,肿瘤是一种细胞分化异常所致的疾病,另一方面,肿瘤细胞也可以在某些因子作用下发生分化,朝正常方向改变。而细胞分化的分子遗传学基础，是基因的选择性激活、转录和翻译^［8］。

　　细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程, 是细胞主动参与的“自杀”机制。近年来的研究表明,许多抗肿瘤药物均可诱导肿瘤细胞凋亡,可能是这些药物抑制肿瘤细胞生长的机理之一。细胞凋亡现象为肿瘤药物治疗提供了新的思路^［9］。

　　在哺乳动物细胞周期进程中,从DNA复制到分裂期的转变，存在一系列的调节因子,即细胞周期素依赖性激酶。近期有许多CDKS的抑制因子被克隆出来,包括p16(MTS1)、p21(WAF1)、p27(KIP1)等,其中p21是包括促进细胞分化在内的作用最广泛的一个。它是p53的下游基因,可被p53活化,起到调控细胞周期进程,引起癌细胞死亡的作用。本实验中，经大蒜油处理的人胃癌BGC-823细胞的p53和p21 mRNA表达水平较对照组显著增高。此结果提示，大蒜油可通过促进抑癌基因p53和p21的表达，抑制细胞恶性增殖，诱导凋亡，促进细胞分化。