人胃癌结直肠癌组织中的端粒酶活性

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：陈雯　张桥　万德森　寸凌云　吴成秋　潘志忠

单位：510089 广州 中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室［陈雯、张桥、寸凌云(硕士研究生)、吴成秋］；广州中山医科大学肿瘤医院腹外科(万德森、潘志忠)

　　关键词： 胃肿瘤；结肠肿瘤；直肠肿瘤；端粒酶；肿瘤标记

　　【摘要】　目的　细胞中端粒(telomere)的长度与细胞寿命的调控密切相关，端粒长度的维持需要端粒酶(telomerase)的激活，近年来的研究发现，端粒酶的激活与肿瘤的发生、发展关系密切。本文报道人胃癌和结、直肠癌端粒酶活性。方法　采用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)来检测人胃癌(11例)、结肠癌(9例)和直肠癌(20例)以及其中39例相应的癌旁组织中的端粒酶活性。结果　在40例肿瘤组织中，有36例端粒酶呈阳性(90%)，且与肿瘤发展阶段、恶性程度不相关；而39例癌旁组织中只有1例阳性。结论　端粒酶可能是肿瘤诊断的一个很好的指标，有关端粒酶特性及调控方面研究的深入将有助于发展新的肿瘤确诊方法。

　　Telomerase activity in human gastric and colorectal cancer　　Chen Wen, Zhang Qiao, Wan Desen, et al. Department of Health Toxicology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089

　　【Abstract】　Objective　To study telomerase activity in patients with gastric and colorectal cancer.Methods　Telomerase activity in tumor samples, including 9 colonic, 20 rectal and 11 gastric carcinomas, was examined by telomeric repeat amplification protocol(TRAP) assay. Thirty-nine samples from tumor-adjacent tissues were also assayed.Results　Ninety per cent(36 out of 40 tumor samples) exhibited telomerase activity regardless of tumor stage or differentiation. However, telomerase activity in the tumor-adjacent tissues could be detected only in 1 of 39 specimens.Conclusion　Telomerase may be a good diagnostic biomarker for tumor detection.

　　【Subject words】　Stomach neoplasms　　Colonic neoplasms　　Rectal neoplasms　　TelomeraseTumor biomarkers

　　1989年Morin^［1］首先在人宫颈癌Hela细胞株中发现有端粒酶活性，但未引起人们的注意。直到1994年Counter等^［2］发现端粒酶活力仅存在于腹水转移卵巢癌中，而正常的卵巢上皮组织则检测不到，这才受到关注。同年Kim等^［3］改进了检测的方法，使端粒酶的检测更加简易和敏感。我们采用现在国际上普遍测定端粒酶活性的TRAP法，测定40例人胃癌、结直肠癌肿瘤组织及其相应的癌旁组织中端粒酶的表达，以探讨端粒酶作为肿瘤诊断指标的可行性，并为进一步的研究打下基础。

材料与方法

　　1.试剂：端粒酶活性测定试剂盒(TRAP-eze telomerase detection kit)购自Oncor. Inc；细胞裂解液中的主要试剂EGTA、PMSF、CHAPS等购自Sigma公司；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；PBR 322 DNA/Hae Ⅲ Markers购自华美生物工程公司；丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺、TEMED购自Serva。

　　2.肿瘤组织与肿瘤细胞株来源：9例结肠癌、20例直肠癌及11例胃癌组织以及它们相应的癌旁组织均由广州中山医科大学肿瘤医院腹外科提供；阳性对照细胞：人鼻咽癌上皮鳞状细胞株(CNE2)由中山医科大学肿瘤研究所提供。所有的癌组织及癌旁组织术后都经过病理验证。

　　3.蛋白提取和蛋白浓度的测定：细胞蛋白和组织蛋白的提取分别按Kim等^［3］的方法进行。蛋白质浓度测定用考马斯亮蓝G-250染色法。

　　4.端粒酶活性测定：由于端粒酶含有RNA组分，为了防止RNase酶污染，所有的实验用品都要经过高压消毒，整个操作过程需带上手套，蛋白提取和PCR反应应在不同的工作台上操作，以避免交叉污染，出现假阳性。操作基本按试剂盒提供的步骤进行，但对PCR的扩增条件做了改变，由循环参数94℃ 30秒、60℃ 30秒，30个循环变成94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 1.5分钟，31个循环，72℃延伸10分钟。此试剂盒在Kim的方法基础上做了一些改进，有以下几点优点：(1)两个引物可同时加入；(2)在反应体系中加入了另外一对引物(终产物为36 bp的寡核酸片段作为内对照)以检测PCR的反应效率；(3)TSR8对照模板可用作相对定量等。PCR的扩增产物用12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(电压为125V，电泳4小时)，最后用硝酸银染色法(银染)来观查结果。

　　5.统计学上用SSPS软件的χ²检验来分析。

结果

　　1.端粒酶检测方法的建立：本实验采用非同位素标记的TRAP法，灵敏度接近同位素标记法^［4］。TRAP扩增产物经凝胶电泳分离及银染后，在聚丙烯酰氨胶上可见跑在最前面的一条带是长度为36bp的内对照，以后是特征性的相距6个bp的梯度条带(从50 bp开始)。按照试剂盒的定性标准，当扩增产物的条带数量(50 bp开始计算)≥4条带，并且每条带之间刚好相距6 bp时，端粒酶为阳性。本实验的检测灵敏度为相当于10～20个肿瘤细胞的蛋白提取物。

　　2.端粒酶在消化道肿瘤组织中的表达：表1示端粒酶在消化道肿瘤组织中的检测结果，由表1中数字可得出本实验端粒酶测定对肿瘤诊断的灵敏度为a/(a+c)=90%；特异性为d/(d+b)=97%；阳性准确率为a/(a+b)=97%。

　　表2为肿瘤组织的病理资料，经统计学(χ²检验)分析发现，端粒酶活性与肿瘤诊断的年龄、性别、发展阶段及分化程度无相关关系。

表1　端粒酶在消化道肿瘤组织中的表达

　　注：χ²=60.63，P＜0.001；a,c分别为肿瘤组织中阳性和阴性的例数；b,d分别为癌旁组织中阳性和阴性的例数

讨论

　　端粒长度被认为是细胞的“有丝分裂钟”。正常体细胞由于末端复制问题，端粒随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒长度的维持需要端粒酶的激活，端粒酶在正常人体中，只在生长速度很快的胚胎、骨髓和生殖等细胞中才能检测到，而在大多数分化了的体细胞中则检测不到^［5］。正常体细胞分裂了一定数目

表2　40例消化道肿瘤的病理资料

　　后会逐渐老化，而肿瘤细胞由于端粒酶激活维持了端粒的长度使细胞获得永生。国外的研究证明，绝大部分的肿瘤呈端粒酶阳性，Shay等^［6］总结了正常组织(196例)、原位癌(410例)、恶性肿瘤(2 031例)和癌旁组织(690例)中端粒酶的阳性率，它们分别为0.5%、30.0%、85.0%和11.0%。本实验检测的40例胃、结直肠肿瘤及39例癌旁组织中，端粒酶的阳性率分别为90.0%和2.6%，与文献报道基本相符。另外，我们发现端粒酶的活性与肿瘤的发展阶段及恶性程度不相关，这与大多数的报道也相符。

　　细胞内除端粒酶外，还存在其他的调节端粒长度的因素，如端粒结合蛋白、端粒结构等，而端粒酶本身的激活也受一些因子的调控。在一些生物细胞及人的肿瘤细胞中发现了非端粒酶依赖性端粒维持方式^［7］，这可以解释为什么不是所有的肿瘤组织中都有端粒酶的活性。

　　端粒酶的激活发生在癌变过程的哪个阶段及是否能作为肿瘤诊断的指标?这是人们普遍感兴趣的问题。大多数学者认为，端粒酶激活可能发生在癌变过程的晚期，因为端粒酶在一些组织增生病变、良性肿瘤及癌前病变组织中的阳性率不高，临床上也发现后期肿瘤细胞的阳性率高于早期肿瘤细胞^［8］，故端粒酶活性是否能作为早期诊断的指标仍需进一步的研究。由于端粒酶在恶性肿瘤组织中有很高的阳性率而且检测方法非常灵敏，所以它可作为某些肿瘤诊断或辅助诊断的指标，尤其是在鉴别炎症性疾病、良、恶性肿瘤及术后复发追踪等方面有着重要的意义^［6］。一些学者收集尿液或肠道灌洗液中的脱落细胞，测定端粒酶活性来探讨其作为诊断指标的可行性^［9，10］，结果表明端粒酶的阳性率为60%。我们相信，随着端粒酶研究的深入，人们对端粒酶可否作为肿瘤确诊的指标这个问题会有更正确的认识。　　本课题受国家自然科学基金资助(39670644)

参考文献

　　1Morin GB. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 1989, 59: 521-529.

　　2Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci(USA), 1994, 91:2900-2904.

　　3Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266: 2011-2015.

　　4Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL, et al. Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP). Methods Cell Sci, 1995, 17:1-5.

　　5Lundblad V, Wright WE. Telomeres and telomerase: a simple picture becomes complex. Cell, 1996, 87: 369-375.

　　6Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol, 1997, 50: 106-109.

　　7Bryan TM, Englezou A, Gupta J, et al. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. EMBO J, 1995, 14: 4240-4248.

　　8蒋建飞，丁健. 端粒酶—肿瘤治疗的新靶子. 国外医学肿瘤学分册，1997，24：29-31.

　　9Yoshida K, Sugino T, Tahara H, et al. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer cells in urine. Cancer, 1997, 79: 362-369.

　　10Yoshida K, Sugino T, Goodison S, et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. British J Cancer, 1997, 75: 548-553.

(收稿：1997-10-27　　修回：1998-01-19)