Cx基因在胃癌细胞株中的表达及诱导分析

癌症 2000年第5期第19卷 基础研究

作者：施正专　沈守荣　邹益友　李桂源　阳惠湘

单位：施正专　沈守荣　邹益友　阳惠湘(湖南医科大学湘雅医院消化科，营养科,湖南 长沙410008)；李桂源(湖南医科大学肿瘤研究所，湖南 长沙410078)

关键词：胃肿瘤；Cx基因；表达；诱导

　　【摘要】目的：探讨胃癌细胞株MGC803在全反式维甲酸(all-rans-retinoic,RA)、佛波酯(phorbolester,TPA)及二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）3种诱导剂分别作用后,胃癌细胞中间隙连接蛋白(connexin,Cx)基因表达变化。方法：采用比较多重RT－PCR－Southern blot方法检测。结果：维甲酸、二甲基亚砜对胃癌细胞基因组中Cx43基因有诱导表达作用，同时该株细胞本身表达的Cx46在维甲酸及佛波酯作用后明显减弱甚至消失。结论：Cx43基因在胃癌细胞中有可诱导性，这为今后探索维甲酸、二甲基亚砜等对胃癌细胞恶性表型的抑制，为胃癌细胞基因组中Cx43基因的表达模式在临床上的应用提供了理论依据和实验基础。

　　中图分类号：R730.23文献标识码：A文章编号：1000－467X(2000)05－0423－03

Expression and induction of connexin genes in gastric carcinoma cell line

SHI Zheng-zhuan, SHEN Shou-rong, ZOU Yi-you, et al.

　　(Department of Gastroenterology ＆ Department of Nutriology, Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008,P.R.China)

　　【Abstract】 Objective： To dectect Cx mRNA expression in gastric carcinoma cell line MGC803 and its changes after treated with all-trans-retinoic(RA), phorbol ester(TPA), dimethyl sulfoxide(DMSO) respectively. Method： Comparative multiple RT-PCR-Southern blot were used. Result： Both RA and DMSO induced Cx43 mRNA expression whereas TPA and RA reduced Cx46 mRNA expression in MGC803 cell line. Conclusions： Cx43 gene expression was detected in gastric carcinoma cell and the expression level changed after differentiation inducer treatment.

　　Key words： Stomach neoplasms; Connexin genes; Expression; Induction

　　胃癌细胞中间隙连接蛋白(connexin,Cx)基因是一个由十多个成员组成的与细胞增殖，分化和发育密切相关的^[1]超基因家族，其编码产物为细胞间隙连接通道的装配蛋白，是细胞间间隙连接通讯的关键结构。丢失间隙连接介导的胞间通讯是转化细胞和癌性细胞得以自主生长的常见方式。在人类大多数恶性肿瘤中，Cx基因的表达严重受抑^[2]，且受某些促分化剂如RA、cAMP等的调节^[3,4]。Cx基因的转染可以抑制某些转化细胞或恶性细胞的转化表型或恶性行为，因此具有肿瘤抑制基因的功能^[3]。本文采用促分化剂RA，DMSO及TPA处理胃腺癌细胞株MGC803，观察处理前后5种CxmRNA表达变化，旨在探讨Cx基因的表达在胃癌形成中的可能机制，并为胃癌细胞基因组中Cx基因的表达模式在临床上的应用奠定实验与理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　胃癌细胞株MGC803在RPMI-1640，10％小牛血清中于37℃，5％CO₂饱和湿度中培养。质粒及引物（见表1）由湖南医科大学肿瘤研究所提供。TRIzol^TMRNA抽提试剂及RA、TPA、DMSO 3种诱导剂均为Sigma公司产品，cDNA合成试剂盒及随机引物标记试剂盒为Promega公司产品。

表1　PCR引物序列

　　1.2方法

　　1.2.1探针的制备：5种Cx质粒DNA（pCx26,pCx32,pCx37,pCx43,pCx46）的抽提、纯化及其插入片段的酶切鉴定回收按常规方法进行^[5]。使用前参照随机引物法用[α-³²p]dCTP标记探针。

　　1.2.2化学物质处理MGC803细胞及细胞总RNA的抽提和纯化：当细胞生长至汇合期，在相同的培养条件下分别用RA、TPA、DMSO处理。RA浓度为1×10-5mol/L,TPA为100μg/L,DMSO作为溶剂对照，其加入量与溶解TPA所需量相等；作用时间RA为24小时，TPA与DMSO均为5小时。收获细胞后抽提细胞总RNA（按试TRIzol^TM剂盒说明），然后用DNaseI消化，测定OD值，－70℃贮存备用。

　　1.2.3比较多重RT-PCR-Southern杂交分析：先按照Promega公司RT试剂盒说明，将mRNA逆转录成cDNA,再取cDNA产物5μl为模板进行扩增反应：反应体系50μl，其中含1×TaqDNA聚合酶缓冲液，1.5mmolMgCl₂，200μmoldNTPs，0.4μmol目的片段引物，0.1μmol内对照引物，TaqDNA聚合酶2.5u。PCR反应条件为95℃5分钟，94℃、54℃及72℃各1分钟，循环22次。阳性对照以质粒DNA为模板，仅加目的片段引物，阴性对照取DNaseI消化后的RNA取代cDNA模板，加内对照引物进行扩增。进一步将上述RT-PCR产物电泳分离，变性中和，转膜后紫外交联。再以[α-³²p]dCTP标记的Cx或内对照为探针先后进行Southernblot分析，具体操作均按常规方法^[5]。2结果

　　在胃癌细胞基因组中Cx43杂交信号在未处理组难以检测到，而在经RA、TPA、DMSO三组化物质处理后均出现与阳性对照相一致的杂交信号；在内对照信号中，处理组和对照组均有一致的杂交信号；杂交信号光密度值分析亦提示处理组均使Cx43表达增强以RA组和DMSO组为明显（图1）。然而Cx46杂交信号在对照组中可检测到与阳性对照一致的杂交信号，而经RA、TPA处理后有明显减弱甚至消失。内对照中处理组和对照组均有相一致的杂交信号，杂交信号光密度值分析亦提示RA、TPA均可使Cx46表达减弱，DMSO亦有较弱程度的类似作用(图2)。

　　3讨论

　　Cx基因能够抑制肿瘤细胞生长，在肿瘤基因组中极少发生突变，且用基因转染^[6]或诱导剂处理可增强其表达，被认为属于第二类抗癌基因^[3,4]。在胃正常组织细胞中Cx43蛋白是构成间隙连接通道的主要成员，而在胃癌细胞中表达减少或缺失^[7]。有报导Cx43基因在某些组织细胞中检测到其5’-UTR上游距转录起始点近端有与转录活性有关的AP-1位点及变异的TATA盒，激素应答元件^[8]。有人还比较了小鼠、大鼠、人及小牛的Cx433’-UTR，都含有4个保守的AUUUA重复序列，可能与Cx43mRNA的稳定性有关^[9]。

图1比较多重RT-PCR-Southern-blot检测MGC803在诱导剂处理后Cx43mRNA表达

　　A：1：Cx43阳性对照；2：对照组；3：TPA处理组；

　　4：RA处理组；5：DMSO处理组

　　B：2～5分别为A组中相应的GAPDH内对照

图2比较多重RT-PCR-Southern-blot检测MGC803在诱导剂处理后Cx46mRNA表达

　　A：1：Cx46阳性对照；2：对照组；3：TPA处理组；

　　4：RA处理组；5：DMSO处理组

　　B：2～5分别为A组中相应的GAPDH内对照

　　本实验中,三种化学物质(RA,DMSO,TPA)均诱导MGC803胃癌细胞中弱表达的Cx43基因表达增强。由此我们推测其作用机制：一方面可能是加入诱导剂后,直接作用于调控序列如AP-1位点激活Cx43基因转录;另一方面也可能是胃癌细胞中不稳定的Cx43mRNA降解过快导致了弱表达。而加入诱导剂后,通过一定方式的调节使其稳定性增强,降解减少,表达量增多。

　　有研究发现Cx43的羟基端有2个PKC磷酸化位点^[10],RA增强Cx43mRNA表达可能是经转录后调节^[11],因而我们推测,RA与其结合蛋白或受体结合后激活PKC系统使某种结合蛋白磷酸化结合于Cx43mRNA的磷酸化位点拮抗AU重复序列所致的不稳定性,使mRNA降解减少,从而使Cx43mRNA表达量增多。

　　TPA作用的双重性早有报导,其作用性质可能与细胞的种类及细胞当时所处的机能状态有关,对于处于增殖状态细胞促使其分化,反之对处于分化状态的细胞则促进其增殖。TPA促分化的作用机制可能是使PKC在细胞内重新分布,或产生拮抗上皮生长因子,或是激活某种抑瘤基因^[4]。在子宫平滑肌细胞中,经CAT分析及AP-1位点突变分析^[8]提示，TPA经激活PKC后与转录因子c-jun,c-fos共同作用于AP-1位点,使Cx43基因转录活性增强。

　　本实验中TPA(100μg/L)处理MGC803胃癌细胞5小时后,Cx43mRNA有表达增强的同时,却使其本身表达的Cx46(在正常胃组织中未检测到表达,待发表资料)表达明显减弱,其程度强于PA、DMSO的作用，说明Cx46与Cx43基因结构的差异性。因而推测Cx46在胃癌细胞中的表达可能是恶性肿瘤细胞中基因表达的变异：恶性瘤细胞群体为了突破正常的Cx基因的转录活性关闭所致的通讯障碍压力而表现的一种重建基因表达体系，试图建立新的间隙连接通讯的应答反应，但其表达产物不可能有效地形成细胞间隙连接通道：Cx46与Cx43均属于Cx家族的α-亚类，结构的同源性有可能使Cx43变异为Cx46；TPA对Cx46基因表型的抑制说明了这种变异的可逆性，这为我们阐明胃癌癌变机理提供了新的思路。

　　基金项目：国家自然科学基金(NO：39670344)资助

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收稿日期：1999－07－13;修回日期：1999－11－24