细胞色素P4502E1基因多态性与胃癌的关系

　　福建医科大学学报1999年第33卷第3期

蔡　琳　俞顺章

　　目的：探讨人体代谢亚硝胺的重要同功酶细胞色素P4502E1(CYP2E1）基因多态性与胃癌危险性的关系。方法：应用病例对照分子流行病学研究方法，采用聚合酶链和限制性片段长度多态性技术，对福建省胃癌高发区长乐市91例原发性胃癌病例和94例人群对照的DNA进行CYP2E1基因型检测和分析。结果：CYP2E1 的C1/C2和C2/C2基因型频率在胃癌病例和对照中分别为36.26%和24.47%，Fisher's精确概率检验χ²=5.344, P=0.069。胃癌病例中罕见纯合子C2/C2基因型6例（6.59%），而对照中仅1例（1.06%）。胃癌病例组CYP2E1的C2等位基因频率显著高于对照组（OR=1.86,95%CI =1.07～3.25）。携有CYP2E1非C1/C1基因型者若饮酒或长期食用鱼露，发生胃癌的危险性明显增大。结论：携带CYP2E1的C2/C2基因型的个体可能与胃癌的高风险有关。

　　关键词：胃癌　细胞色素P4502E1　基因多态性

　　大量研究表明胃癌的发生与环境因素、特别是与饮食因素关系密切，其中食物来源的N-亚硝基化合物与胃癌病因之间的联系是众多学者关注的热点^［1］。细胞色素P450是外源性化学物质在体内生物转化第I相反应中的最重要的代谢酶，它是一个超基因家族^［2,3］。其中细胞色素P4502E1（CYP2E1）是二甲基亚硝胺D-脱甲基酶，它参与亚硝胺及其前致癌物N-亚硝基四吡咯的代谢^［4,5］，且在人群中存在基因多态现象^［6］。在癌变的始动阶段，代谢酶基因多态性对决定环境致癌剂的效应往往起着关键作用。关于CYP2E1与胃癌的关系迄今国内外尚未见报道。本研究对CYP2E1基因多态性与胃癌的关系作一探讨。

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象　病例和对照均为福建省胃癌高发区长乐市居民。病例是经市级以上医院病理确诊的原发性胃癌新病例。随机抽取与病例同性别、同民族、同居住地、年龄差别小于3岁的健康人群为对照。

　　1.2　主要试剂　蛋白酶K(MERCK产品），购自华美生物工程公司。Taq DNA多聚酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、MgCl₂和DNA Markers均为Promega生物有限公司产品。限制性内切酶PstI和RsaI及相应的缓冲液为MBI Fermentas公司产品。CYP2E1引物由加拿大上海Sangon公司合成（PAGE纯化）。

　　1.3　外周血基因组DNA提取　用蛋白酶K消化细胞核，酚-氯仿-异戊醇抽提，紫外光分光光度计定量后备用。

　　1.4　PCR扩增　参照文献^［7］构建CYP2E1基因扩增引物，其序列为5'CCAGTCGAGTCTACATTGTCA3'(1370～1349)和5'TTCATTCTGTCTTCTAACTGG3'(999～978)。PCR扩增体系反应总体积为50 μl,内含100～600 ng模板DNA，1 μmol/L引物，200 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl₂，TaqDNA聚合酶2.5 U和相应的缓冲液。扩增在Perkin-Elemer 4800型基因扩增仪上完成。用优质石蜡油50 μl封盖，95℃预变性8 min，在冰水浴上加入Taq酶2.5 U。热循环参数为：94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，进行35个循环后，于72℃延伸10 min。CYP2E1基因扩增片段长度为410 bp（图1）。

图1　CYP2E1基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

　　m:DNA Markers； 1～6:来自不同受试者的DNA样品.

　　1.5　酶切反应　取PCR扩增产物15 μl,用限制性内切酶PstI(10 U)或RsaI(5 U)37℃消化18 h。在2.2%的琼脂糖凝胶上,60 V电泳2 h,紫外光下检测DNA酶切片段条带（图2）。

图2　PCR扩增的CYP2E1基因片段经Pst1限制酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱

　　1,3,5,7,9,11,13:样本对照； 8:C2/C2纯合子; 2,12,14:

　　C1/C1 纯合子; 4,6,10:C1/C2杂合子.

　　1.6　统计分析　计算CYP2E1基因型频率和等位基因频率，应用Epi-Info软件进行χ²　检验、比数比及95％可信限计算等分析。

　　2　结　果

　　2.1　病例对照均衡性检验　检测血样185例，男性159例，女性26例，病例和对照均为汉族。其中原发性胃癌病例91人，对照94人。病例对照组男女性别构成差异的显著性检验：χ²＝0.26,P=0.61。胃癌病例平均年龄58.17±11.04岁（34～79岁），对照平均年龄58.42±10.93岁（32～78岁）。胃癌病例与对照在年龄性别分布上均衡可比。

　　2.2　CYP2E1基因型年龄分布　研究对象的CYP2E1的三个基因型的年龄分布差别无统计学显著意义,病例对照CYP2E1基因型分布与年龄无关（P＞0.05）(表1)。

表1　胃癌病例和对照的CYP2E1基因型与年龄分析

　　2.3　遗传平衡检验　应用Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验方法，把计算得到的基因频率代入，计算基因型平衡频率，再乘以总人数，求得预期值（e）。把观察数（O）与预期值（e）作比较，进行χ²检验。病例组和对照组的基因型分布的观察值和预期值差异无显著性（P＞0.05），符合遗传平衡定律（表2）。

表2　Hardy-Weinberg遗传平衡检验

　　 χ²=1.2894,P＞0.05; χ²=0.242,P＞0.05.2.4　CYP2E1基因多态分析　在检测的185例中,CYP2E1基因C1/C1型129 例(69.7%),杂合子C1/C2型49 例(26.5%)，罕见纯合子C2/C2 型7例(3.8%)。胃癌病例C1/C2基因型27例、C2/C2基因型6例，均多于对照组,其合并频率为36.26%, 高于对照组(24.47%）(表3)。

表3　胃癌病例与对照的CYP2E1基因型分布(n,%)

　　 趋势检验χ²=4.597,P=0.032. Fisher's精确概率χ²=5.344,P=0.069.　　胃癌病例的C2等位基因频率高于对照组，OR＝1.86(95%CI＝1.07～3.25),显示具有C2/C2基因的个体有患胃癌的较高风险(表4)。

表4　胃癌病例和对照组CYP2E1等位基因频率分布

　　 OR=1.86(1.07～3.25); χ²=4.91,P＜0.05.2.5　CYP2E1基因多态、饮酒与胃癌　对CYP2E1基因多态与饮酒暴露进行叉生分析，把不饮酒和携带C1/C1基因型视为参照组，则非C1/C1基因型者胃癌发生的危险较大（表5）。

表5　CYP2E1基因型、饮酒与胃癌的关系

　　 χ²=15.36,P=0.001. 　χ²_trend=52.268,P=0.00000.2.6　CYP2E1基因多态、食用鱼露与胃癌　鱼露中含有多种可亚硝化的胺类前体，亚硝化后具有直接致突变和诱发大鼠胃腺癌的作用。叉生分析发现，CYP2E1非C1/C1基因型者发生胃癌的相对危险性（OR）为1.81,食用鱼露的OR为12.58, 若同时暴露于两者（CYP2E1非C1/C1 基因型且长期食用鱼露）可使胃癌的危险性增高17.58倍（表6）。

表6　CYP2E1基因型和鱼露摄入与胃癌的关系

　　 常食：≥3次/周，几乎每天食用；少食：＜3次/周. χ²_trend=52.268,P=0.00000.3　讨　论

　　根据亚硝酰胺能诱发多种属实验动物胃腺癌等现象,1983年Mirvish提出了胃癌的亚硝胺病因假设^［8］。亚硝胺类化合物的基本结构可分两大类：亚硝胺和亚硝酰胺。亚硝胺需要经过代谢活化才能致癌,在代谢酶作用下，首先将一侧的烷基的α位碳羟化，然后经脱烷分解为烷基离子而将机体成分烷基化。核酸的烷化改变了遗传密码，进而使细胞发生转化。

　　95％以上的环境致癌剂属前致癌物，许多环境致突变物亦为间接致突变物，它们进入体内后主要经P450混合功能氧化酶催化，形成亲电子中间产物，损伤DNA进而启动致癌或致突变过程。不同个体对环境中各种前致癌物的活化解毒能力的遗传差异决定了个体对肿瘤的易感性。

　　由于人类CYP450基因存在遗传多态性，其基因所处环境差别而产生对不同同功酶的诱导，故每个人的CYP450酶活性均有差异。CYP2E1是人体代谢亚硝胺的重要同功酶。Hayashi等报道CYP2E1等位基因C2的CAT转录活性比C1高10倍^［9］。Tsutsumi发现肝脏中CYP2E1 C1/C2活性高于C1/C1基因型^［4］。Hildesheim等研究了CYP2E1基因多态在鼻咽癌病因学上的作用，发现携带纯合子变异性基因者发生鼻咽癌的危险性比携带纯合子野生型基因者高5～8倍^［10］。由于大多数致癌物需要代谢酶激活，代谢酶激活能力高的个体其患癌的危险性也高。

　　本研究结果显示胃癌病例组CYP2E1的C2等位基因频率显著高于对照组，携带C2/C2基因型的个体可能与胃癌的高风险有关。有报道乙醇有诱导CYP2E1的作用,饮酒者CYP2E1活性增高,增加了对致癌物的暴露危险。胃癌高发区福建居民喜食的佐餐调味品鱼露中含有多种亚硝胺类前体物,进入体内可代谢合成为有强致突变和强致癌作用的N-亚硝基化合物。对CYP2E1和鱼露联合作用的分析结果显示，长期食用鱼露且CYP2E1非C1/C1型者患胃癌的风险增高（OR=18.58），这是有关CYP2E1基因多态性和食用鱼露与胃癌关系的首次报道，揭示了遗传代谢易感性与环境致病因素暴露在胃癌发病危险中的交互作用。

　　当健康个体具有某种患癌风险或暴露于某种可能的致癌因素时，若采取相应的防范措施可增强机体对抗肿瘤的能力。代谢酶基因多态性与胃癌易患性关系的深入研究将丰富胃癌高发区胃癌病因学及流行病学研究内容，提高对致癌剂受染者肿瘤易患的预测水平，对当地居民改变不良的饮食习惯，提高健康水平具有重要的指导意义。CYP2E1基因多态在亚硝胺类致癌物的代谢活化中的作用值得进一步探讨。

　　(长乐市卫生局、长乐市肿瘤研究所热情支持现场工作，谨致谢意！)

　　福建省科技三项费资助课题（K98031）及美国中华医学会（CMB）资助项目（86459）

　　作者单位：蔡　琳　福建医科大学流行病学教研室(福州　350004)

　　俞顺章　上海医科大学流行病学教研室(上海　200032)

　　参考文献

　　1　Neugut AI,Hayek M,Howe G. Epidemiology of gastric cancer. Seminars Oncolog, 1996;23:281

　　2　Slaughter RL,Edwards DJ. Recent advances: the cytochrome P450 enzymes. Ann Pharmacother, 1995;29:619

　　3　Nebert DW. P450 genes: structure, evolution, and regulation. Ann Rev Biochem, 1987;56:945

　　4　Tsutsumi M,Matsuda Y,Takada A. Role of ethanol-inducible cytochrome P-450 2E1 in the development of hepatocellular carcinoma by chemical carcinogen, N-nitrosodimethylamine. Hepatology, 1993;18:1483

　　5　Yang CS,Yoo JSH,Ishizaki H,et al. Cytochrome P450 2E1: Roles in nitrososamine metabolism and mechanisms of regulation. Drug Metab Rev, 1990;22:147

　　6　Hu Y,Oscarson M,Johansson I,et al. Genetic polymorphism of human CYP 2E1: Characterization of two variant alleles. Molecul Pharmacol, 1997;51:370

　　7　Pajarinen J,Savolainen V,Perola M,et al. Polymorphism in the cytochrome P450 2E1 gene and alcohol-induced disorders of human spermatogenesis. Internat J Androl, 1996;19:314

　　8　Mirvish SS. The etiology of gastric cancer: intragastric nitrosamide formation and other theories. J NCI, 1983;71:629

　　9　Hayashi S,Watanabe J,Kawajiri K. Genetic polymorphisms in the 5'-flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P450 2E1 gene. J Biochem, 1991;110:559

　　10 Hidesheim A,Chen CJ,Caporaso NE,et al. Cytochrome P450 2E1 genetic polymorphisms and risk of nasopharyngeal carcinoma: results from a case-control study conducted in Taiwan. Cancer Epidem Biomark Prev, 1995;4:607