腹膜乳斑在胃癌腹膜播散过程中的作用

　　中华实验外科杂志2000年第17卷第3期

安伟德　胡祥　郭文斌　沈忠义

　　摘　要　目的　研究胃癌腹膜播散过程中腹膜乳斑的作用。方法　在3组实验动物中，分别向大鼠腹腔内接种经5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyurdine, 5-BrdU)标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞，每毫升数量分别为1×10⁵个、1×10⁶个和1×10⁷个。应用免疫组织化学染色，观察癌细胞的分布。计数网膜乳斑或非乳斑区标记细胞的数量，确定癌细胞的分布。结果　在乳斑或非乳斑区平均标记细胞数3组的比率分别是163∶1(1×10⁵个/ml组)、280∶1(1×10⁶个/ml组)和697∶1(1×10⁷个/ml组)。在乳斑或非乳斑区标记细胞数比较差异有非常显著性(P＜0.01)。结论　标记细胞选择性地侵入网膜乳斑。在胃癌腹膜播散的早期，癌细胞具有特异地侵入腹膜乳斑的特性。

　　关键词：乳斑　胃癌　腹膜播散

　　我们以网膜作为研究材料，通过向大鼠腹腔内接种经5-溴脱氧尿苷(5-bromocleoxyurdine, 5-BrdU)标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株，追踪观察其分布情况以及在乳斑中的集聚状态，从而研究网膜乳斑与胃癌细胞腹膜播散的关系。

　　材料与方法

　　1.实验动物及移植瘤准备：雄性SD大鼠，鼠龄3～4周，体重70～80 g，由大连医科大学提供。移植前使用60 mg/kg体重环胞霉素A(cyclosporin A，德国)抑制大鼠细胞免疫功能；环磷酰胺(0.02 mg/kg体重)处理大鼠腹腔。腹水传代细胞株，是由中国医科大学提供的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株。移植瘤自携带的裸鼠腹腔内提取后，洗涤离心除去上清细胞碎片和红细胞，加入1640完全培养液(RPMI 1640，美国Gibco公司，20%灭活小牛血清)，细胞浓度调至为1×10⁹个/L备用。

　　2.5-BrdU行S期细胞标记：将处理后细胞悬浮液中加入5-BrdU，分别为0.5、5和50 mg/L时行S期细胞标记，放置在37 ℃体积分数为5% CO₂孵箱中，每种浓度分别孵育12、24、48和72 h，然后从不同时间的4瓶单细胞悬液中各自提取5 ml，以1 000 r/min离心5 min，重复3次，以除去游离的5-BrdU^［1］。然后行细胞活性及5-BrdU的细胞标记指数的测定。

　　3.标记后细胞活性及5-BrdU标记指数的测定：应用台盼兰排除法测定细胞活性。通过免疫细胞化学方法(ABC法)测定细胞标记指数。

　　4.动物分组与网膜免疫组织化学染色：将单细胞悬液加入5-BrdU 5 mg/L标记孵育24 h后，对经处理的SD大鼠行腹腔内接种。SD大鼠分为3组，每组10只，3组腹腔内分别注入标记细胞1×10⁸个/L、1×10⁹个/L和1×10¹⁰个/L。接种后的SD大鼠饲养24 h，处死将大网膜切下展平、固定在4%磷酸盐缓冲液(PBS)福马林液中过夜。然后使用1∶100稀释的鼠抗5-Brdu单抗(Sigma)4 ℃ 24 h对大鼠网膜做免疫组织化学染色，最后用生物素标记二抗室温孵育2 h，DAB显色5 min。标本用甲基绿做复染，脱水，放置在立体显微镜下观察5-BrdU标记癌细胞的分布。

　　5.标记细胞的计数分析：应用计算机扫描图像分析仪(Leica Q500MC)对乳斑或非乳斑区标记细胞进行计数分析。

　　6.统计学处理：应用配对t检验。

　　结　　果

　　1.5-BrdU的标记率及细胞活性：用抗5-BrdU单抗行免疫化学染色，检测Sy86B人胃癌细胞S期的5-BrdU细胞标记率如图1，用台盼兰排除法测定细胞活性如图2。单细胞悬液以5 mg/L加入5-BrdU孵育24 h较理想，其细胞标记率为(74.8±1.6)%，细胞活性率为(91.8±1.2)%。

注：A：50 mg/L，B：5 mg/L,C:0.5 mg/L

1　各种条件下5-BrdU的标记指数

　　2.乳斑和非乳斑区标记细胞数量：3组(1×10⁸个/L、1×10⁹个/L、1×10¹⁰个/L)5-BrdU标记的癌细胞，在乳斑上、非乳斑区分布的结果以及平均标记细胞数的比率见表1。应用抗5-BrdU抗体对网膜行免疫组织化学染色，在显微镜下所观察到经5-BrdU标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞选择性地侵入网膜乳斑。在所有观察标本中，乳斑和非乳斑区每平方毫米5-BrdU标记细胞数经配对t检验，差异有非常显著性(P＜0.01)，随着接种标记细胞数的增加比率增加。

注：A：0 mg//L，B:0.5 mg/L, C:5 mg/L, D:50 mg/L

2　各种5-BrdU浓度标记下细胞活性

表1　乳斑和非乳斑区5-BrdU标记细胞数量(X±s)

　　注：与非乳斑区比较，^*P＜0.01

　　讨　　论

　　本研究结果表明，检测5-BrdU的S期细胞标记指数为(74.8±1.6)%，用台盼兰排除法测定细胞活性，细胞活性率为(91.8±1.2)%。说明此项标记技术对Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞标记指数是较高的，而且不影响细胞活性。本研究结果显示，大鼠腹腔内接种5-BrdU标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株，其主要集中于网膜乳斑中，乳斑内5-BrdU标记细胞远比非乳斑区内多，差异有显著性(P＜0.01)，而且改变接种细胞浓度仍显示同样的倾向。本研究结果提示，癌细胞在腹腔内接种其分布主要集中在乳斑中，有分布、播散的区域性，证实腹膜乳斑具有胃癌细胞腹膜播散中早期特异性选择点的作用。

　　基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(9810500106)

　　作者单位：安伟德（116011大连医科大学附属第一医院普外科）

　　胡祥（116011大连医科大学附属第一医院普外科）

　　沈忠义（116011大连医科大学附属第一医院普外科）

　　郭文斌（大连市中心医院）

　　参考文献

　　［1］John SM, Sherri LK, Jackie MH, et al. Bromodeoxyuridine labeling for sphase measurement in breast carcinoma. Cancer, 1993,71:3 531-3 674.