胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA克隆

　　第四军医大学学报1999年第20卷第9期

　　崔大祥　闫小君　苏成芝

　　摘　要　目的：分离克隆测序胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA.方法：采用mRNA差异展示技术从胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株中分离出一差异表达基因片段，对其命名，并进行克隆、测序及GenBank检索；以此片段作探针与细胞株总RNA进行打点杂交.结果：从差示PCR电泳凝胶中分离出大小为416bp的差异表达片段，命名为gcys-18；RNA打点杂交证实gcys-18在GC7901中呈高表达，在GES-1中呈低表达，表明gcys-18是真正差异表达片段；对gcys-18进行了序列分析及GenBank检索，示其为新序列后递交给GenBank，它的GenBank接受号为AF071057.结论：分离并克隆了胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA，此基因可能与胃癌发生发展有关.

　　关键词：胃肿瘤　基因表达　克隆分子　序列分析　打点杂交

　　0　引言

　　胃癌在世界上的恶性肿瘤中占第2位，在我国居各类恶性肿瘤之首.胃癌的发生与多种因素有关.这些因素在不同阶段作用于不同基因，引起相关基因表达水平改变，最终导致胃癌的发生发展.现代分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，它们的选择性表达决定了机体整个生命过程，其表达变化处于控制生物学调节机制的中心位置.因此，研究胃癌在不同发展阶段的基因表达变化，有助于阐明胃癌的发病机理，为进一步开展胃癌的基因诊断和基因治疗提供重要的理论依据.本研究采用mRNA差异展示技术分离出一个胃癌异常表达基因gcys-18,并对其进行了克隆测序.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　①细胞株：胃癌7901细胞株由第四军医大学动物实验中心提供，胃粘膜GES-1细胞株购自北京市肿瘤防治研究所.②PCR扩增仪系美国Barnstead公司产品.③PCR产物纯化试剂盒及测序试剂盒分别是Promega公司的wizard^TM PCR preps DNA纯化试剂盒，fmol^TM sequencing kit,丙烯酰胺、双丙烯酰胺、尿素、Tris碱、EDTA皆购自华美公司.④α-³²P dATP，γ-³²P dATP皆购自北京福瑞公司，PCR试剂系本所提供.⑥差示PCR引物：采用GenHunter公司1996-04提供的序列,Venderbilt大学合成.5′端引物为H-AP₇5′-AAGCTTAACGAGG-3′，3′端引物为H-T₁₁C:5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′.

　　1.2　方法　①常规培养胃癌7901细胞株，按文献培养胃粘膜GES-1细胞株^［1］.②采用异硫氰酸胍一步法分离细胞株、组织及血标本中的总RNA，用无RNase的DNase去除其中的DNA，紫外扫描定量后稀释成0.1g/L,于-20℃保存.③mRNA反转录以H-T₁₁M(M=G,C,orA)，为起始引物，依次加入无RNase的水9.4μL，5×RT Buffer4.0μL，dNTP（250μmol/L）1.6μL，总RNA（0.1g/L）2.0μL,H-T₁₁M2.0μL,反应条件为：65℃5min，37℃60min，75℃5min,MMLV反转录酶（200U/μL）在37℃10min时加入.④PCR扩增、60g/L测序胶电泳、放射自显影、差异条带的确认及回收以及差异条带的二次扩增按文献进行^［2］.⑤按试剂盒说明书纯化PCR产物.⑥采用末端标记法在PCR产物末端标记上γ-³²PdATP作探针，对胃癌及胃粘膜细胞株总RNA进行打点杂交^［3］.⑦对纯化的二次扩增产物直接进行序列分析^［4］.⑧对PCR产物测序结果进行GenBank同源性检索，确认为新序列后，把PCR产物克隆入T载体，并进行全自动测序，同时递交序列给GenBank^［5］.

　　2　结果

　　2．1　mRNA差异展示结果　Fig1.

图1　mRNA差异展示结果

　　fig1　Result of mRNA differential display

　　1：GES-1 electrophoresis lane；

　　2：GC7901 electrophoresis lane；A:Differential band of gcys-18

　　2．2　RNA打点杂交结果　Fig2.

图2　打点杂交结果

　　fig2　Result of dot blot

　　1：Positive and negative control；

　　2：Result of dot blot of gcys-18 to total RNA of GC7901 and GES-1.

　　2．3　克隆及酶切鉴定结果　碱裂解法提质粒，经HindⅢ酶切分析，证实克隆成功（Fig3）.

图3　酶切鉴定结果

　　fig3　Restriction analysis of cloned plasmid

　　1：Marker;2：Plasmid/HindⅢ;3：Cloned plasmid.

　　2．4　全自动序列分析结果

　　1 AAGCTTAACG AGGTCCCCGT GATGCAGCTG

　　CCCCGGGCAC CGACCAGCGA TGTGCTCTCA

　　61 GCCCCCGACA GGTTTCCTGG AAGATGGCGC

　　CATTCTGGAT GATGCGGGGG CACTTGCGGT

　　121 AGAAGA CACGCACGGCGATG AGGGACATGC

　　AGCCGCCATA GTCCTGGAAG CCAGGTAGAA

　　181 GCCGCTGCGG TGACACAGGT CCGAAGCTCC

　　GCACCTCGGT CGTTGACGTT TCATGACGGC

　　241 GGCCACCTCA GGTCCACCTG GGAGAAGCTC

　　TCGTCGGCTG CAATGGTATC CACCTTCACC

　　301 CATGGATTCT CCATCCAGTT GGGGAAGGTT

　　GGGCGTAGTA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC

　　361 TGTGTGGAAA TTGTATCCGC TCATAATTCC

　　AGACTACATG ACGGAGCCGG AAGCAT

　　2.5　检索结果　GenBank检索示gcys-18与HEK5部分同源，GenFinder分析认为gcys-18处于编码区，氨基酸推导并检索分析认为无同源性蛋白结构.

图4　PCR产物直接测序的部分结果

　　fig4　Part result of direct sequencing of gcys-18 production

　　3　讨论

　　本实验采用mRNA差异展示技术，以GC7901与GES-1为研究对象，分离出一个在GC7901中呈高表达而在GES-1中呈低表达的基因片段，命名为gcys-18，基因库检索显示与HEK5部分同源.HEK5是酪氨酸蛋白激酶基因家族的成员，编码酪氨酸激酶受体，在细胞信号传导、生长控制及肿瘤发生中起重要作用.最近几年此家族又添新成员，gcys-18是否为其新成员，现在还不能作出结论.进一步分析显示，gcys-18处于编码区，它的全长基因还未获取.目前认为，基因表达水平的改变是最根本的改变，也是相当敏感的改变，它的改变反映了机体的状况，即机体的不同状况在基因水平上特征性的代表变化就是表达水平的改变.gcys-18的表达水平代表了胃癌的何种特征性变化？它的具体功能如何，仍不清楚，仍有待于进一步研究^［6～8］.

　　总之，gcys-18的研究刚刚开始，阐明其结构与功能具有十分重要的意义.

　　基金项目：军队卫生科研基金资助课题　No.98D44

　　作者简介：崔大祥，男，1967-02-03生，安徽省桐城市人，汉族.生化与分子生物学博士，讲师，发表论文21篇.Tel：（029）3374771　E-mail　cuidx@igd.edu.cn

　　作者单位：第四军医大学基因诊断技术研究所，陕西　西安　710033

　　参考文献

　　1 柯　杨，宁　涛，王　冰et al.人胃粘膜上皮细胞系GES-1的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志,1994;16(1):7-10

　　2 Cui DX,Yan XJ, SuCZ. Differentially expressed genes in GC7901 orGES-1 were isolated and their primary clinical significance. J Fourth Mil Med Univ, 1998;19(6):601-605

　　3 Regina VL,Niels B,Thomas B et al. Rapid selection and classification of positive clones generated by mRNA differential display. Nucleic Acids Res,1996;24(7):1385-1386

　　4 王　亮，张金三，朱　丹 et al. 快速可靠的双链PCR产物直接测序. 生化与物理学进展，1995； 21（4）：458-459

　　5 Yong ML. World Wide Web and computer software in molecular biology. A Collection of Papers 97 Beijing International Conference of Medical and Biology High-tech,1997;10:91-100

　　6 徐光炜. 我国胃癌防治研究的回顾与展望.中华肿瘤杂志，1990；12 (2)：152-154

　　7 Noda N. Gene expression in gastric carcinoma tissues. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 1995; 96(6): 362-369

　　8 Fox GM, Holst PL, Chute HT. cDNA cloning and tissue distribution of five human EPH-like receptor protein-tyrosine kinases. Oncogene, 1995;10(5): 897-905