细胞内游离Ca^2＋和cAMP浓度在胃癌细胞凋亡过程中的变化特点^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第5期

邢承忠　陈峻青

　　摘　要　目的：探讨胃癌细胞凋亡过程中细胞内游离Ca^2＋（[Ca^2＋]i）浓度和环磷酸腺苷（cAMP）浓度的变化特点及意义。方法：选择顺铂诱导胃癌细胞凋亡，采用光镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡；Fura－2荧光负荷技术测[Ca^2＋]i，竞争性蛋白结合法测cAMP浓度。结果：顺铂浓度为2μg/ml作用于胃癌细胞24小时出现典型的凋亡改变，即凋亡小体、细胞皱缩，染色质固缩和片段化，DNA梯状条带，流式细胞仪上见“凋亡峰”；胃癌细胞凋亡过程中[Ca^2＋]i明显升高，以凋亡早期更为明显，cAMP浓度也高于对照组。结论：[Ca^2＋]i和cAMP浓度在胃癌细胞凋亡过程中表现为上调趋势。

　　关键词：胃癌细胞　凋亡　Ca^2＋　cAMP

　　近年研究表明，肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病^[1]，胃癌的发生、发展和浸润转移也与凋亡密切相关^[2,3]。Ca^2＋和cAMP是各种生命现象信号传导中的重要信号分子，但在胃癌细胞凋亡中的意义，尚未见报道。本研究采用顺铂诱导人胃癌细胞系BGC823凋亡，并检测细胞凋亡各阶段细胞内游离Ca^2＋浓度（[Ca^2＋]i）和cAMP浓度的变化，以探明Ca^2＋和cAMP在胃癌细胞凋亡中的变化特点。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂和仪器

　　RPMI1640美国LIFETECH公司产品；胰蛋白酶（Trypsin）美国Difco公司产品；顺铂为山东齐鲁制药厂产品；钙荧光指示剂Fura－2/AM为美国Sigma公司；125I－cAMP试剂盒为上海中医药大学产品。透射电镜Hitachi－600和扫描电镜Hitachi－450均为日本日立公司产品；流式细胞仪FACScan美国BectonDickinson公司；电泳仪DGENE美国Bio－Rad公司；F－2000荧光分光光度计日本HITACHI公司；液体闪烁计数仪LS－6500为美国Beckman公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1细胞培养人胃癌细胞系BGC823（由北京医科大学引进）复苏后培养于含10％小牛血清的RPMI1640营养液中，2～3天传代一次。取对数生长期细胞，加顺铂至终浓度为2μg/ml，选择不同时间点用光镜、常规透射电镜和扫描电镜制片观察凋亡的形态学变化。收集各时间点细胞（106个），提取DNA，用含溴化乙锭的1.5％的琼脂糖电泳观察DNA条带，照像；收集时间点细胞（106个），制成细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞周期分析，激光激发波长为488nm。

　　1.2.2[Ca^2＋]i测定胃癌细胞系BGC823加顺铂后不同时间收集细胞，用0.25％台盼蓝染色，计数活细胞为95％以上，细胞悬液37℃预温5分钟，加入终浓度5μmol/LFura－2/AM，37℃，恒温振荡45分钟，持续通95％O2、5％CO2混合气，以一定量HPSS终止反应，1000转/分离心5分钟，弃上清，再次洗一次（同上），最后细胞悬液于HPSS中调整细胞数为2×106个/ml，每次测Ca^2＋浓度前再以HPSS离心洗一次（同上），以分光光度计检测，发射光波长为510nm，激发光波长为340及380nm，两波长下最大荧光由加入终浓度为0.2％Triton测得，最小荧光由加入终浓度为8mmol/L(pH＞8.5)的EGTA获得，每次测Ca^2＋前输入在上述两激发波下测得的细胞悬液自发荧光值及解离常数（224nmol/L），输入电脑软件运算可得出[Ca^2＋]i值。

　　1.2.3cAMP检测方法生长状态较好的细胞接种于24孔板培养，分对照组（未加药组）、加顺铂诱导凋亡组（加药后30秒至24小时），稀释成2×104个细胞/ml，最终反应体积为1ml，沸水中煮沸3分钟终止反应，取50μl（含103个细胞）缓冲液置于－20℃冻存待测cAMP。据¹²⁵I－cAMP放免试剂盒说明作标准曲线并测每一样品的cAMP浓度（pmol/10³cell）。

　　1.3　统计学处理用t检验

　　2　结果

　　2.1　顺铂诱导胃癌细胞系BGC823凋亡及其检测

　　加顺铂到终浓度为2μg/ml诱导凋亡，加药后24小时出现典型的凋亡改变，即相差显微镜：用顺铂处理24小时后见细胞核浓缩，细胞变圆，可见膜突起起泡，细胞完整，见凋亡小体；透射电镜：收集顺铂处理24小时细胞，电镜观察见典型凋亡所见，核染色质积聚边集，新月形或帽状，细胞器结构清晰，胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片；扫描电镜：细胞变圆，胞膜突起起泡，胞核浓缩；琼脂糖凝胶电泳：顺铂处理24小时，在电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带，对照组无此特征；流式细胞仪：顺铂处理24小时，见G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。

　　2.2　细胞内游离Ca^2＋浓度测定结果

　　未加顺铂处理的对照组[Ca^2＋]i波动于124.31～130.24nmol/L，平均浓度为126.67±3.06nmol/L。加顺铂至终浓度2μg/ml，诱导凋亡，检测处理1/120(30秒)、2和24小时[Ca^2＋]i，结果表明，细胞凋亡各阶段[Ca^2＋]i明显升高（P＜0.01），而以处理30秒时最高（表1）。

表1　顺铂诱导凋亡过程[Ca^2＋]i浓度(x±s)nmol/L

t值为加药组与对照组比较的

　　2.3　胃癌细胞凋亡各阶段cAMP浓度测定结果

　　用顺铂诱导胃癌细胞凋亡，对照组cAMP值为0.0213±0.0041pmol/103cell，加药后30scAMP浓度0.0235±0.0034pmol/103cell呈上升趋势，但差异不显著（P＞0.05），加药后2～12小时cAMP浓度为0.0278±0.0029～0.0345±0.0038pmol/103cell，高于对照组，差异显著（P＜0.05）（表2）。

表2　顺铂诱导凋亡时cAMP浓度(x±s)nmol/L

t值是与对照组比较的值

　　3　讨论

　　胞浆内信号传导过程主要包括三个信使系统^[4]：腺苷酸环化酶系统、肌醇脂质系统和钙－钙调蛋白系统，三个信使系统中的主要信号分子包括cAMP、IP3、PKC、Ca^2＋等，而Ca^2＋在信号传导中起重要作用，是各条信号传导通路的枢纽^[5]。正常状态下Ca^2＋主要存在于细胞外，细胞内游离Ca^2＋含量很低，然而正是这些含量甚微的Ca^2＋却发挥着重要作用^[4]。因此，本研究首先选择细胞内游离Ca^2＋作为研究胃癌细胞凋亡信号传导机制的突破点，应用Fura－2为结合Ca^2＋的荧光指示剂测定胃癌细胞凋亡各阶段[Ca^2＋]i的动态变化，对此国内外尚未见报道。研究结果表明，对照组细胞内游离Ca^2＋浓度为126.67±3.06nmol/L，加顺铂诱导凋亡早期（30秒）细胞内游离Ca^2＋浓度迅速升高为244.00±9.85nmol/L，明显高于对照组（P＜0.01），加药后2小时和24小时[Ca^2＋]i为181.33±3.51和187.67±4.51nmol/L，虽较30秒时[Ca^2＋]i降低，但仍明显高于对照组（P＜0.01）。既往用Vp16诱导乳癌细胞凋亡以及用肿瘤坏死因子诱导乳癌细胞凋亡时，也发现[Ca^2＋]i升高，激活Ca^2＋依赖核酸内切酶引起DNA片段化和细胞凋亡^[6,7]。本研究证明胃癌细胞凋亡时[Ca^2＋]i也升高，与其它肿瘤细胞凋亡时[Ca^2＋]i变化一致，说明Ca^2＋在胃癌细胞凋亡过程中也起重要作用。同时，本研究还发现胃癌细胞凋亡早期（30秒），[Ca^2＋]i升高尤为明显，可推测[Ca^2＋]i升高在胃癌细胞凋亡启动时具有重要作用。细胞内cAMP含量甚微，在不受刺激的情况下为0.1nmol/mg以下，cAMP作为第二信使参与细胞的增殖、分裂、脂肪分解等多种生命活动^[4,8]。本研究用顺铂诱导胃癌细胞凋亡，动态检测凋亡各阶段cAMP的变化，结果表明，随着凋亡的发生，cAMP呈上升趋势，特别是反应6小时以后差异显著，说明cAMP参与细胞凋亡的信号传导，且呈上调趋势。有研究表明，肿瘤细胞增殖时cAMP呈下降趋势，而用化疗药抑制其生长时，cAMP含量升高^[9]。David研究cAMP在细胞凋亡时的变化发现，用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡，cAMP含量升高^[10]。在胃癌细胞凋亡时亦发现cAMP升高，因此，通过提高胞浆cAMP来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增生，已成为胃癌治疗研究的新线索。

　　＊本文课题受辽宁省自然科学基金资助(编号972276)

　　作者单位：中国医科大学第一临床学院肿瘤科（沈阳市110001）

　　参考文献

　　1 　Marx J.Cell death studies yield cancer dues.Science,1993;259:760～ 1

　　2　 Saegusa M,Takano Y,Wakabayashi T,et al.Apoptosis in gastric carcinoma and its association with cell proliferation and differentiation. Jpn J Cancer res,1995;86:743～ 8

　　3　 Yuh－ Fang Chang,Li－ Lydia Li,Chew－ Wun Wu,et al. Paclitaxel induced apoptosis in human gastric carcinoma cell lines. Cancer,1996;77:14～ 8

　　4　 曹泽毅.激素受体及临床应用.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1993:48～70

　　5　 Cole KA,Kohn EC. Calcium－ mediated signal transduction: biology,biochemistry and therapy.Cancer Metastasis Rev, 1994;13:33～ 41

　　6　 Sokolova IA,Cowan KH,Schneider E.Ca^2＋/Mg^2＋－dependent endonuclease activation is an early event in Vp16－ induced apoptosis of human breast cancer MGF 7 cells in vitro. Biochem Biophys Acta, 1995;1266:135～ 42

　　7　 Bellomo G,Perotti M,Taddei F,et al. Tumor necrosis factor α induces apoptosis in mammary adenocarcinoma cells by an increase in intranuclear free Ca^2＋ concentration and DNA fragmentation. Cancer Res,1992;52:1342～ 6

　　8　 刘景生.细胞的信息传递及第二信使.生理科学进展,1987;4:367～74

　　9　 Mestdagh N,Vandewalle B,Hornez L,et al. Comparative study of intracellular calcium and adenosine 3′ ,5′ － cyclic monophosphate levels in human breast carcinoma cells sensitive or resistant to adriamycin contribution to reversion of chemoresistance. Biochem Pharmacol,1994;48:709～16

　　10　 David J,McConke Y,Orrenius S,et al.Agents that elevate cAMP stimulate dNA fragmentation in thymocytes.J Immunol,1990;145:1227～ 30