胃癌前病变及胃癌中细胞凋亡及其与FasL表达的关系

世界华人消化杂志 1999年第7期第7卷 研究原著

作者：刘海峰　刘为纹　房殿春　门荣甫　王振华

单位：第三军医大学西南医院消化科　重庆市　400038

关键词：胃肿瘤；癌前状态；细胞凋亡；FasL 基因

　　摘　要

　　目的　研究胃癌前病变及胃癌中细胞凋亡与FasL表达的关系，探讨细胞凋亡在胃癌发病中的作用.

　　方法　采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组化染色对正常胃粘膜10例，慢性胃炎72例和胃癌50例中凋亡细胞及FasL表达状态进行原位观察和比较.

　　结果　萎缩性胃炎、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型肠化生及异型增生的凋亡细胞指数(12.8%，17.0%，14.6%，9.6%，8.0%)显著高于正常粘膜(3.4%)和癌(5.8%)(t=5.61，7.57，5.18，4.71，4.03；t=4.33，6.43，4.15，3.07，2.11；P＜0.01及P＜0.05)；异型增生组织凋亡细胞指数(8.0%)显著低于萎缩性胃炎和Ⅰ型、Ⅱ型肠化生(12.8%，17.0%，14.6%；t=2.67，4.73，2.92；P＜0.05及P＜0.01)；Ⅲ型肠化生的凋亡细胞指数(9.6%)显著低于Ⅰ型、Ⅱ型肠化生(17.0%，14.6%；t=3.69，2.13；P＜0.01及P＜0.05). 正常胃粘膜无FasL表达，胃癌前病变及胃癌中均有不同程度的FasL表达. FasL表达阳性肠化生、异型增生和胃癌中的凋亡细胞指数(19.8%，10.0%，8.3%)显著高于其阴性组(12.6%，6.1%，3.4%；t=2.55，2.30，5.19；P＜0.05及P＜0.01).

　　结论　FasL对胃癌前病变及胃癌组织细胞凋亡具有促进性调控作用. 细胞凋亡调控异常在胃癌发病中可能起重要作用.

　　中国图书馆分类号　R735.2

Apoptosis and its relationship with Fas ligand expression in gastric carcinoma and its precancerous lesion

LIU Hai-Feng, LIU Wei-Wen, FANG Dian-Chun, MEN Rong-Fu and WANG Zhen-Hua

　　Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China

　　Subject headings　stomach neoplasms; precancerous condition; apoptosis; Fas Ligand gene

　　Abstract

　　AIM　To investigate the effects of apoptosis and Fas ligand (FasL) in different stages of malignant transformation of gastric epithelium in precancerous lesions and gastric carcinomas.

　　METHODS　Using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) technique and immunohistochemical staining, we observed the apoptotic cells and the FasL expression in situ in 10 normal gastric mucosa, 70 chronic gastritis and 50 gastric carcinoma .

　　RESULTS　The apoptotic indexes in atrophic gastritis, type Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ intestinal metaplasia and gastric dysplasia (12.8%，17.0%，14.6%，9.6%，8.0%)were significantly higher than that in normal mucosa(3.4%) and gastric carcinoma(5.8%；t=5.61，7.57，5.18，4.71，4.03；t=4.33，6.43，4.15，3.07，2.11；P＜0.01 and P＜0.05). The apoptotic index in gastric dysplasia (8.0%) was significantly lower than that in atrophic gastritis and type Ⅰ，Ⅱ intestinal metaplasia(12.8%,17.0%，14.6%；t=2.67，4.73，2.92；P＜0.05 and P＜0.01) and the apoptotic index in type Ⅲ intestinal metaplasia(9.6%) was significantly lower than that in types Ⅰand Ⅱ (17.0%,14.6%； t=3.69，2.13；P＜0.01and P＜0.05). FasL intestinal metaplasia was differently expressed in gastric carcinomas and precancerous lesions. In intestinal metaplasia, gastric dysplasia and gastric carcinoma, the apoptotic index in the FasL positive group (19.8%，10.0%，8.3%)was higher than that in the FasL negative group(12.6%，6.1%，3.4%；t=2.55，2.30，5.19；P＜0.05and P＜0.01).

　　CONCLUSION　The abnormal regulation of apoptosis may play an important role in the pathogenesis of gastric carcinoma. The FasL can promote apoptosis in gastric carcinoma and its precancerous lesions.

　　0　引言

　　细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程，此过程的异常与肿瘤的发生有密切关系^［1］. Fas配体(Fas ligand, FasL)是一种介导细胞凋亡的膜蛋白，与其受体Fas分子结合后，Fas分子向细胞内传导细胞凋亡信号，引起Fas表达细胞凋亡^［2］. 过去认为人类只有激活的T淋巴细胞有FasL表达^［3］，但近来发现一些肿瘤细胞亦有FasL表达^［4-8］. 为了解FasL是否在胃癌和癌前病变中表达及其与细胞凋亡的关系，我们采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组化染色对胃癌及癌前病变中FasL表达状态及其与细胞凋亡间的关系进行观察，以期了解它们在胃癌发病中的作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　收集内镜活检标本及胃癌手术切除标本共132例，其中含正常胃粘膜10例，慢性胃炎伴萎缩者16例，伴肠化生者36例，伴异型增生者20例，胃癌50例. 胃癌患者在手术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗. 所有标本均经100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，并经HE染色病理诊断证实.

　　1.2　方法

　　1.2.1　TUNEL染色　细胞凋亡原位检测试剂盒(In situ cell death detection kit, POD)为德国Boehringer Mannheim公司产品. 染色步骤：①切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；②3mL/L H₂O₂封闭30min；③20mg/L蛋白酶K消化液作用20min；④TUNEL反应液，37℃孵育60min；⑤过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37℃孵育30min；②～⑤步后均以10mmol/L PBS(pH 7.4)振洗3次，每次5min；⑥DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片. 以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，阳性对照切片经DNaseⅠ预处理10min，再接TUNEL染色步骤.

　　1.2.2　FasL免疫组化染色　 兔抗人FasL多克隆抗体及免疫组化试剂盒(Immunostain SP kit)均为美国Santa Cruz公司产品. 石蜡切片常规脱蜡、水化，继以免疫组化试剂盒检测，步骤按说明书进行. 以PBS替代一抗作阴性对照.

　　1.2.3　粘液组织化学染色及肠化分型　采用AB(pH2.5)/PAS和HID/AB(pH2.5)两种粘液组织化学染色. 根据肠化生粘膜上皮组织学形态和细胞分泌粘液不同，并参照Filipe et al^［9］的标准，将肠化生分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型.

　　1.2.4　观察指标　光镜下观察TUNEL染色及免疫组化染色切片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于1000个细胞，计数阳性细胞数并以百分数表示，分别作为TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)指数及FasL阳性细胞密度，FasL表达阳性细胞数≥10%为阳性，＜10%判为阴性.

　　统计学处理　所得数据分别用t检验或χ²检验.

　　2　结果

　　TUNEL阳性反应物质呈棕黄色，主要位于细胞核内，浓缩的核质紧贴于核膜，或核质呈现均匀的染色，少数细胞浆内亦有淡着色. 正常胃粘膜凋亡细胞主要位于表面上皮内，萎缩性胃炎、肠化生及异型增生组织凋亡细胞数量明显增多，在粘膜全层均可见到，胃癌组织凋亡细胞数量明显减少，呈单个散在分布和(或)簇状分布(图1). 不同胃粘膜病变中的凋亡细胞指数见表1. 萎缩性胃炎、Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型肠化生、异型增生的凋亡细胞指数显著高于正常粘膜和癌(P＜0.01)；异型增生的凋亡细胞指数显著低于萎缩性胃炎和Ⅰ型、Ⅱ型肠化生(P＜0.05及P＜0.01)；Ⅲ型肠化生的凋亡细胞指数显著低于Ⅰ型、Ⅱ型肠化生(P＜0.01及P＜0.05)，与异型增生的凋亡细胞指数无显著差异；胃癌组织的凋亡细胞指数显著高于正常粘膜(P＜0.01).

图1　胃癌组织中的凋亡细胞，呈簇状分布倾向TUNEL染色×200

表1　不同胃粘膜病变中的凋亡细胞指数

^bP＜0.01， vs 正常胃粘膜；^aP＜0.05，vs 异型增生； ^dP＜0.01，vs 萎缩性胃炎、Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型肠化生；^cP＜0.05，vs 萎缩性胃炎；^fP＜0.01，vs Ⅰ型、Ⅱ型肠化生； ^hp＜0.01，vsⅠ型肠化生；^eP＜0.05，vsⅡ型肠化生.]

　　FasL阳性反应物质呈棕黄色，位于细胞浆内和(或)细胞膜上，未见核内表达(图2). 正常胃粘膜无FasL表达，萎缩性胃炎、肠化生、异型增生及胃癌中均有程度不同的FasL表达，但表达率相差无统计学意义(表2).

图2　胃癌组织，FasL阳性反应物质位于胃癌细胞胞膜及胞质内SP法×200

表2　不同胃粘膜病变中FasL免疫组织化学结果

　　比较不同胃粘膜病变中FasL表达阳性组和阴性组中的凋亡细胞指数，发现肠化生、异型增生和胃癌组织中FasL表达阳性组显著高于其阴性组(P＜0.05及P＜0.01)，见表3. 经连续切片观察，FasL表达与凋亡细胞分布在多数病例具有同域性.

表3　不同胃粘膜病变中FasL表达与细胞凋亡的关系

^aP＜0.05，^bP＜0.01， vs FasL阴性组.

　　3　讨论

　　细胞凋亡异常在肿瘤发生发展过程中具有重要的病理生理意义^［1，10］. 既往认为胃癌形成是细胞无限增殖所致的细胞积聚，近年发现胃癌中不仅存在细胞过度增殖，同时存在细胞凋亡异常^［10］. 但对细胞凋亡的意义、尤其是细胞凋亡在胃癌前阶段的特点尚了解很少. 由慢性炎症→萎缩→肠化生→异型增生→胃癌的发展过程已得到大多数学者的认同，研究细胞凋亡及其调控基因在胃粘膜癌变过程中的变化规律将有助于揭示胃癌发生的机制. 本结果显示，在胃癌发生的早期阶段存在活跃的细胞凋亡，而随着胃粘膜细胞恶性转化程度的升高，细胞凋亡逐渐减少，表明在胃粘膜癌变过程中可能存在细胞凋亡的被抑制. 细胞凋亡受抑，细胞存活期延长，死亡率下降，细胞数目增加，从而表现出明显的生长优势，可能是胃癌发生的一个重要基础. 此外，应该凋亡的异常细胞得以长期生存，这些细胞对致突、致癌剂的易感性升高，基因更易发生突变，增加了胃粘膜细胞恶性变的机会. 胃粘膜癌变过程中细胞凋亡异常的机制尚不清楚，可能与细胞凋亡的调控失常有关^［9］.

　　FasL和TNF是目前认识的两个仅有的介导细胞凋亡的蛋白分子，FasL的研究将有助于对细胞凋亡认识的深入. 新近研究发现，FasL不仅在激活T淋巴细胞表达，在肝癌、肺癌和结肠癌细胞中亦有表达^［4-8］. 因此，了解FasL在胃癌前病变及胃癌中的表达状态及其与细胞凋亡异常之间的关系具有重要意义. 本文初步研究发现，正常胃粘膜无FasL表达，胃癌前病变及胃癌中均有不同程度的FasL表达，FasL表达阳性肠化生、异型增生及胃癌细胞凋亡指数显著高于其阴性组，表明FasL可能不同程度的参与了胃癌前病变及胃癌组织细胞凋亡的调控，对胃癌前病变及胃癌细胞凋亡具有促进性调控作用，细胞凋亡调控异常可能在胃癌发病中起重要作用. 胃癌前病变及胃癌组织表达FasL，不仅可以介导表达Fas的胃癌前病变及胃癌细胞凋亡，而且可能介导胃癌前病变及胃癌组织中表达Fas的浸润淋巴细胞凋亡，从而使胃粘膜恶性转化细胞逃逸机体通过Fas系统途径的免疫清除机制，成为胃癌发生、存活及发展的重要的潜在生物学基础，具体机制及FasL表达与其他凋亡相关蛋白的关系还不十分清楚，有待进一步研究.

　　作者简介：刘海峰，男，1965-11-06生，河北省景县人，汉族. 1988年第三军医大学毕业，1995年第三军医大学医学博士，讲师. 主治医师，主要从事消化系病诊治研究工作，发表论文19篇.

　　军队医药卫生“九五”重点课题资助项目，No.96Z047.

　　通讯作者　刘海峰，400038，重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号，第三军医大学西南医院消化科.

　　Supported by the fund for Key Projects in the Army Medical and Health 9th 5-year Plan, No.96Z047.

　　Correspondence to:LIU Hai-Feng, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 30 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038,China

　　Tel. +86·23·65318301 Ext.73049

　　4　参考文献

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　　10 Que FG, Gores GJ. Cell death by apoptosis: basic concepts and disease relevance for the gastroenterologist. Gastroenterology, 1996;110:1238-1243

收稿日期　1999-01-03　修回日期　1999-03-15