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PCR法检测胃癌组织中幽门螺杆菌

PCR法检测胃癌组织中幽门螺杆菌

世界华消化杂志 1998年第8期第0卷 临床经验

作者:李若平1 张振科2 姚希贤2 任锡玲21 李兰更2

单位:1解放军271医院消化科 天津市 300191;2河北医科大学第二医院消化科 石家庄市 050000

关键词:胃肿瘤/微生物学;螺杆菌,幽门;腺癌/微生物学;聚合酶链反应

  Subject headings stomach neoplasms/microbiology; Helicobacter pylori; adenocarcinoma/microbiology; polymerase chain reaction

  中国图书资料分类号 R 735.2

  1 对象和方法

  1.1 对象 本研究选用河北医科大学第二医院1995年度经外科手术病理证实为胃癌的10例患者,年龄47岁~56岁,男7例,女3例,其中贲门胃底癌1例、胃窦癌6例、胃体小弯侧癌3例,病理均为腺癌. 对此10例切除具有癌灶标本用石蜡包埋备用.

  1.2 方法 组织切片:取备用之胃癌石蜡包埋组织块用切片机切成厚度为10 μm薄片,每例均切2片,用无菌小镊夹入盛有0.5 ml二甲苯溶液的无菌Eppendorf管内,每次操作完后对刀片、小镊子用二甲苯认真擦洗,以防止交叉污染. 脱蜡:用微量离心机(12000 r/ min)离心5min沉淀组织和残存的石蜡,小心吸去壁上残存的二甲苯,再重复上述操作一次,加入0.5 ml无水乙醇翻转混匀,再用微量离心机离心5min,小心吸去乙醇,然后再次加入0.5 ml无水乙醇并翻转混匀离心5min,尽可能除去壁上残存的乙醇,真空干燥2 h,使乙醇完全挥发,干燥时用封口膜封住Eppendorf管,并在其上打几个小孔,防止污染. 模板(Template)提取:向上述干燥后的Eppendorf管内加入100 μl裂解液混匀,然后加入4 μl蛋白酶K,50℃水浴1 h,取出后置于沸水浴5min,最后离心(15000 r/ min)5min,取10 μl备用. PCR扩增:采用上海复华实业股份有限公司生物技术中心生产的Hp基因检测试剂盒,该试剂盒选择互补于Hp种尿素酶A基因片段为特异引物,引物1:5'-GCCAATGGTAAATTAGTT-3',引物2:5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3',按顺序在500 μl的无菌Eppendorf管内加入18 μl反应液,2 μl稀释后的FD DNA polymerase, 10μl模板DNA提取液并做阳性对照(阴性对照加10 μl无菌双蒸水),摇匀后加20 μl液体石蜡,短时离心,置93℃保温4min,再按下列步骤操作,变性93℃ 30S→退火50℃ 30S→延伸72℃ 60S,将Eppendorf管置于军事医学科学院研制的JK-236型PCR自动循环仪进行35个循环,最后置于72℃ 5min. 电泳鉴定:取10 μl扩增产物(扩增片段为430 bp)与1 μl溴酚蓝混匀,用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴乙锭)经TAE电泳30min(电压5V/ cm),用紫外线投射仪检查,若标本扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置,可判定标本为Hp阳性,否则为阴性(见图1).

  2 结果

  10例石蜡包埋癌组织中有6例Hp阳性(其中胃窦癌4例,胃体小弯侧癌2例),其余4例为阴性;上述结果说明:本组病例中Hp在癌灶内较多,但因病例少未做统计学处理.

图1 1.DNA分子量标准参照物 PGEM 3Zf(+) Hae Ⅲ

  2.胃癌石蜡包埋组织 3.阳性对照物  4.阴性对照物

  3 讨论

  自1983年 Warren与Mashall从胃粘膜中分离出幽门螺杆菌后,十多年来国内外学者对Hp感染与胃癌的关系从多方面做了大量研究. 目前多数学者已经认为Hp是慢性活动性胃炎病原菌,是消化性溃疡的重要致病因子,可能是胃癌的协同致癌因子. 在对Hp与胃癌的研究中大量临床研究资料证明:在胃癌灶之外的胃粘膜做Hp培养. 病理组织学及PCR检测Hp,证明Hp主要存在于癌旁组织中,因而提出Hp做为胃癌发生的启动因子[1],可能是通过Hp感染→慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→胃癌这一过程发挥其协同致癌作用[2-6]. 只有个别报道在癌灶组织中行病理学检查Hp存在,如杨润宽[7]报道对2例贲门癌,74例非贲门癌(其中有16例早期胃癌和30例胃癌手术标本)的癌灶组织用Warthin-Starry染色,发现早期胃癌癌灶中Hp检出率为81.3%(13/ 16),非贲门癌中Hp检出率为75.4%(43/ 57),粘液腺癌灶中Hp检出率为30%(3/ 10);本文采用PCR法从10例胃癌石蜡包埋癌灶组织中检测出6例Hp阳性,且均为非贲门腺癌(胃窦癌4例,胃小弯侧癌2例),和杨润宽研究基本一致,这些研究则说明Hp不仅在癌灶旁胃粘膜中存在,而且在癌灶中也存在,这就支持Hp使胃粘膜上皮细胞中的一氧化氮合成酶(iNOS)活化. 癌基因(p53,Bcl-2,C-Ha-ras等)突变及超表达和细胞凋亡等致癌机制假说[1-2]. 由于后者报道较少,故目前对Hp到底是除于癌灶旁存在外,在癌灶中或两处均存在 是否两处Hp存在的比例有差别 等意见尚不一致,故对Hp如何起协同致癌作用的机制很难定论,有待于今后进一步研究,而本文提供的资料对今后深入研究可能有一定作用.

  通讯作者 李若平

  收稿日期 1998-03-28 修回日期 1998-04-17

  4 参考文献

  1 林三仁. 幽门螺杆菌与胃癌关系的进展. 中华消化杂志,1997;17(5):249-250

  2 祖毅. 幽门螺杆菌感染与胃癌关系的研究进展. 国外医学内科学分册,1998;25(2):58-59

  3 Shigeru E, Toshifumi O, Yusuke S, Detection of Helicobacter pylori infection in early stage gastric cancer. Cancer, 1995;75(8):2203-2206

  4 Walker MM, Pretolani S, Gasbarrini G. Gastric carcinoma and gastric lymphoma. Current Opinion in Gastroenterology, 1996;12(Suppl):33-35

  5 Yutaka Hauda, Toshihiko Saitoh, Minoru Kawaguehi, Association of Helicobacter pylori and diffuse type gastric cancer. J Gastroenterol, 1996;31(Suppl 9):29-30

  6 徐世平. 幽门螺杆菌感染与胃癌相关性研究. 中华消化杂志,1997;17(4):211-212

  7 杨润宽. 幽门螺杆菌感染与胃癌相关性研究. 中华消化杂志,1997;17(5):251-253ISSN 1007-9319 CN 14-1218/ R 华消化杂志,1998;6(8):734


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