RT-PCR检测白血病患者mdr1表达的临床研究

临床血液学杂志 2000年第4期第13卷 临床研究

作者：韩艳秋　杨海萍　邰秀珍　杨殿相

单位：韩艳秋（内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特，010059）；杨海萍（内蒙古医学院病理生理教研室）；邰秀珍（内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特，010059）；杨殿相（内蒙古医学院病理生理教研室）

关键词：白血病；聚合酶链反应；多药耐药基因表达

　　摘要　目的：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测多药耐药基因(mdr₁)mRNA的表达，以探讨白血病细胞的抗药性与化疗效果的关系。方法：采用RT-PCR法检测33例不同类型白血病患者mdr₁ mRNA的表达，同时检测20例正常骨髓做对照。结果：对照均为阴性表达，而初治组mdr₁的阳性表达率为35.00%，复发、难治组mdr₁阳性表达率为84.62%(P＜0.01),mdr₁阳性与mdr₁阴性患者的完全缓解率分别为22.22%和73.33%(P＜0.01),临床耐药与非耐药组mdr₁阳性检测率分别为77.78%和26.67%(P＜0.01)。结论：临床白血病化疗耐药的发生主要与mdr₁阳性表达有关。RT-PCR是一种敏感性高、特异性强，可定量检测mdr₁表达的手段。mdr₁表达可作为一个临床化疗耐药指标，有助于白血病个体化疗方案制定。

A clinical study on multidrug resistance gene

　　polymerase chain reaction

HAN Yang-qiu　TAI Xiu-zhen

　　（The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College,Hohhot,010059）

　　YANG Hai-ping　YANG Dian-xiang

　　（Department of Pathopysiology Inner Mongolia Medical College）

　　Abstract　Objective:In order to evaluate relationship between drug resistance of leukemia cells and prognosis.Methods:The expression of multidrug resistance gene( mdr₁)mRNA was measured in 33 patients with different type leukemia and in 20 normal marrow controls by using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:The normal marrow was all mdr₁ negative. The mdr₁ positive rate in untreated group was 35.00%. The mdr₁ positive rate of refractory relapsed group was 84.62%(P＜0.01). The CR rate differed significantly between mdr₁ positive group (22.22%)and mdr₁ negative group(73.33%)(P＜0.01).The mdr₁ positivity of the clinical resistance group was 77.78%,while that of the clinical non-resistant group was 26.67% (P＜0.01). We found that mdr₁ gene expression correlated well with drug resistance to chemotherapy in the patients with leukemia.Conclusion:We thought that the determination of mdr₁ expression level in leukemia could provide a valuble information for designing chemotherapetic regimen in individual patient, and a high level of mdr₁ expression correlated closely with drug resistance in clinical leukemia chemotherapy.

　　Key words　Leukemia　Polymerase chain reaction　Multidrug resistance gene expression

　　目前治疗白血病的主要方法仍为化疗，而化疗成功的主要障碍之一是瘤细胞对化疗药物产生的交叉耐药性^〔1，2〕。研究证实，多药耐药基因(mdr₁)及其基因产物胞膜糖蛋白(P170)起着多药耐药的作用。现已证实mdr₁基因的过度表达与白血病的预后有直接关系，mdr₁表达的程度与化疗疗效及化疗方案选择有相关性^〔1〕。我们对33例白血病患者mdr₁进行分析研究，为克服白血病的多药耐药性提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床病例

　　(1)白血病患者33例，均符合FAB诊断标准，留取骨髓标本33份，其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)20份(M₂ 8份，M₃ 7份，M₅ 4份，M₆ 1份)，急性淋巴细胞白血病(ALL)9份，慢性粒细胞白血病急变3份，浆细胞白血病1份。其中初治组20份(M₂ 6份，M₃ 5份，M₅ 3份，M₆ 1份，ALL 4份，浆细胞白血病1份），复发、难治组13份。男20例，女13例，年龄9～62(平均31.0)岁。难治或临床耐药白血病诊断标准见文献〔3，4〕。(2)采用20例献血员的正常骨髓作对照，其中男9例、女11例，年龄18～50(平均33.0)岁。

　　1.2　细胞分离及总RNA提取

　　抽取骨髓2 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)2000 r/min离心20 min，分离单个核细胞，液氮保存，所用标本约10 μg，采用异硫氰酸胍一步法(AGPC)略加改进提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测RNA浓度和纯度，用灭菌的琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量。

　　1.3　cDNA合成

　　取变性的RNA 0.5 μg加入5 μl的AMV逆转录酶反应体系中，其中使用的引物为随机引物，在37 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，合成cDNA。

　　1.4　PCR扩增

　　(1)引物设计及合成：扩增基因mdr₁及内对照β₂-mG引物设计参照文献〔5〕，由北京赛百盛生物工程公司合成，mdr₁ 5′引物CCCATCATTGCAAT-AGCAGG（2596-2615），3′引物GTTCAAACTTCT-GCTCCTGA（2733-2752），扩增片段为157 bp。内对照β₂-mG，5′引物ACCCCCACTGAAAAAGAT-GA（1543-1562），3′引物ATCTTCAAACCTCCAT-GATG（2253-2262，3508-3517），扩增片段为114 bp。(2)PCR反应体系为25 μl，包括50 mmol/L MgC1₂ 0.8 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl,5 pmol混合引物2.5 μl, Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl,cDNA模板2.5 μl,余量用三蒸水补足混匀,94 ℃变性40 s,55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，扩增30个循环。(3)PCR产物分析：取PCR产物5 μl加1 μl载样缓冲液，在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳(65 V，2 h)，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果并照相，底片在光密度扫描仪上扫描定量，用mdr₁ cDNA/β₂-mG cDNA比值表示mdr₁ mRNA的表达水平。

　　1.5　统计学处理

　　采用Fisher确切概率法和t检验。

　　2　结果

　　利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术和设定的两对引物,分别得到mdr₁ 157 bp和β₂-mG 114 bp产物，同一批反应的不同样本，在扩增模板量相同的情况下，其mdr₁表达明显不同，而β₂-mG表达却基本相同，PCR的阳性结果以肉眼能见其电泳扩增带为判断标准，当被检标本经PCR后同时出现mdr₁及β₂-mG基因PCR电泳扩增带时，判定该标本mdr₁ PCR检出阳性，结果如图1。

图1　PCR产物电泳结果

　　M：Marker,　1～6为患者，　1、2、3、5、6

　　为mdr₁阳性表达，　4为阴性表达

　　对照组20例正常骨髓标本经PCR后均出现β₂-mG基因扩增带，且均未检出mdr₁基因扩增带；33例白血病患者骨髓标本中共检出18例mdr₁阳性。

　　初治组与复发难治组患者mdr₁阳性表达比较见表1。

表1　初治组与复发难治组mdr₁阳性表达比较

　　与初治组比较 ¹⁾　P＜0.01

　　白血病患者mdr₁阳性表达与阴性表达者完全缓解（CR）率比较，mdr₁阳性表达18例，CR4例，CR率22.22%，mdr₁阴性表达15例，CR11例，CR率73.33%，经Fisher法分析P＜0.01，差异有极显著意义。

　　临床耐药与非耐药组mdr₁ mRNA检测结果比较，耐药组(18例)mdr₁阳性表达14例，阳性率77.78%，非耐药组(15例)mdr₁阳性表达4例，阳性率26.67%，经Fisher法分析P＜0.01，差异有极显著意义，耐药组与非耐药组的mdr₁ cDNA/β₂-mG cDNA比值分别为0.4196±0.1559、0.1621±0.0445，经t检验，P＜0.05，差异有显著性意义。

　　白血病mdr₁ mRNA表达与白血病临床特征的关系：本组ALL和ANLL的mdr₁基因表达与年龄、性别、诊断时骨髓幼稚细胞及增生程度、 FAB分型未发现有显著相关性。本组对2例ANLL-M₂患者初治及复发时均进行mdr₁检测，结果初治时均为阴性表达，经化疗后均达CR，1例CR后继续化疗，半年后复发，mdr₁表达转成阳性，再次化疗效果差，最终死亡；另1例CR后服用蒙药治疗，8个月后复发，mdr₁表达仍为阴性，化疗后再次达CR。在复发、难治组中，有1例ANLL-M₃患者，mdr₁高度表达，该患者为住院联合化疗中复发的，但改用复方柏子仁(砷剂)治疗后达CR，至今已2年。在初治组中有1例 ANLL-M₃患者中度表达，该患者未用联合化疗,采用三氧化二砷静脉滴注治疗达CR,至今已2年。另1例ANLL-M₃患者，mdr₁高度表达，住院期间曾用高三尖杉酯碱加阿糖胞苷方案化疗,疗效差,由于经济困难,出院后改用阿糖胞苷及环磷酰胺治疗达CR。

　　3　讨论

　　我们检测了20例正常人骨髓标本，其mdr₁表达均为阴性。检测20例初治急性白血病患者mdr₁ mRNA阳性率为35.00%，其中ANLL为33.33%(5/15)、ALL为50%(2/4)，本组ANLL与ALL的mdr₁表达无显著性差异(P＞0.05)，与Zhou和 Campos曾报道^〔6，7〕ANLL的mdr₁基因表达率相似。本结果提示这种原发性mdr₁基因表达增加可导致耐药的现象不仅见于ANLL，也见于ALL。

　　本研究显示，复发难治组mdr₁阳性率明显高于初治组，而mdr₁阳性组临床CR率明显低于mdr₁阴性组，两项指标均有显著意义(均为P＜0.01)。临床耐药组与非耐药组的 mdr₁阳性率，有显著性差异(P＜0.01)，提示由mdr₁介导的耐药是白血病多药耐药的重要机制。在治疗中发现患者的耐药性与mdr₁的表达程度有一定的相关性，mdr₁高度表达者，临床常规化疗方案难以获得缓解，使用的常规化疗方案多是以MDR相关药物为主，如阿霉素、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙等，它们不能克服mdr₁表达所致的细胞耐药，这也是患者不能获得缓解的主要原因。而复发的患者如mdr₁阴性表达，则经常规方案化疗后易达到再次CR。研究证明，以阿糖胞苷、环磷酰胺等非mdr₁相关药物治疗mdr₁阳性的白血病可提高其缓解水平^〔8〕。

　　mdr₁ cDNA/β₂-mG cDNA的比值高低与临床上患者对化疗药物的敏感性之间有较好的相关性，可望为临床提供一个有意义的指标，临床医师可根据患者mdr₁的表达情况，合理地制定化疗方案，使化疗发挥最有效的作用。

　　参考文献

　　［1］Nooter K,Herweijer H.Multidrug resistance (mdr₁)gene in human cancer. Br J Cancer,1991,63:663～669

　　［2］Marie J P, Zittoun R, Sikjc B I. Multidrug resistance (mdr₁) gene expression in actue leukemias corrdlations with treatment outcome and in vitro drug sensitivity.Blood,1991,78:586～592

　　［3］浦津，刘海川，楼方定，等.急性白血病多药耐药基因表达的临床研究.中华内科杂志,1995，11：655～658

　　［4］Hiddemann W,Buchner T.Treatment strategies in aute myeloid leukemia(AML).Blut,1990,60:163～171

　　［5］Noonan K E, Beck C , Holzmayer T A , et al. Quantitation analysis of mdr₁ (multidruy resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160～7164

　　［6］Zhou D C,Marie J P,Suberville A M,et al.Relevance of mdr_l gene expression in acute myeloid leukemia and comparision of different diagnostic methods.Leukmia,1992,6:879～885

　　［7］Campos L, Guyotal D, Archimband E, et al. significance of multidrug resistance p-glycoprotein expression on acute nonlymphoblastic leukemia cell at diagmosis.Blood,1992,79:473～476

　　［8］Versantvoort C H M, Broxterman H F, Pinedo H M , et al. Enetgydependent processes involved in reduced drug accumulation in multidrug - resistant human lung cancer cell lines without P-glycoprotein expression.Cancer Res,1992,52:17～23

(收稿 1999-09-08　修回 2000-02-23)