MNNG诱发大鼠胃癌与间质血管的反应

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 研究原著

作者：高国林¹　杨　原¹　杨思凤¹　何　净²

单位：1解放军222医院消化实验室　吉林省吉林市　132011;2吉林市第二人民医院

关键词：胃肿瘤/血液供给；内皮，血管/病理学；大鼠，Wistar

Gastric carcinogenesis and reactivity of microvessel induced by N-methl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) in rats

　　gAO Guo-Lin¹, YANG Yuan¹, YANG Si-Feng¹ and HE Jing²

　　¹Gastroenterological Laboratory, Chinese PLA 222 Hospital, Jilin 132011, Jilin Province, China

　　²Second People＇s Hospital, Jilin City

　　Subject headings　stomach neoplasms/blood supply; endothelium, vascular/pathology; rats, wistar

　　Abstract

　　AIM　To study the reactivity of microvessel in gastric carcinogenesis.

　　METHODS Gastric carcinogenesis in rats was induced by topical administration of MNNG (150mg L^-1) in drinking water. Four weeks after MNNG exposure, rats were swichted to the diet containing 1, 25-dihydroxyvitamin D₃［1,25(OH)₂D₃, 2.5mg*kg^-1 and 5.0mg*kg^-1］. Animals were killed at week 8, 16,24 and 32 for immunohistochemical study of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and histopathological investigation.

　　RESULTS At week 8 and 16, microvessel density in gastric mucosa increased and endothelial cells of the microvessls markedly proliferated.

　　CONCLUSION The increased microvessel density is closely related to the severity of carcinogenesis. 1, 25(OH)₂D₃ does not inhibit, but stimulate carcinogenesis induced by MNNG.

　　中国图书资料分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　研究胃癌发生中，间质血管反应的意义.

　　方法　应用N-甲基-N硝基-N亚硝基胍(MNNG)+表面活性剂，对Wistar雄性大鼠进行诱癌实验. 将MNNG溶于蒸馏水中，浓度为150mg/L，供雄性Wistar大鼠(n=150)自由吸饮. 每8wk处死大鼠7只，至32wk实验全部结束. 采用主动脉灌注墨汁观察组织间微血管密度，同时采用血管内皮细胞生长因子(VEGF)和增生细胞核抗原(PCNA)，以观察血管内皮细胞的反应.

　　结果　8wk～16wk粘膜基部血管密度增加，血管内皮细胞明显增生，至24wk发生原位癌，以MNNG+Vit D(5.0mg)组的腺胃癌发生率最高，32wk处死的20只大鼠中有16只大鼠发生原位癌和润癌，肿瘤发生率为80%.

　　结论　血管新生及血管内皮细胞增生与肿瘤生长的速度密切相关，间质组织中血管密度越大，内皮细胞增生越明显，癌细胞生长的速度越快.

　　0　引言

　　实验性胃癌间质组织中血管反应方面的详细探讨尚不多. 笔者曾提出胃癌的形成与血管内皮细胞(EC)增生是同步发生^［1］. 为了进一步明确肿瘤的发生与血管内皮细胞的关系，应用MNNG+表面活性剂^［2，3］对Wistar雄性大鼠进行诱癌实验. 从主动脉灌注墨汁，利于观察组织间血管密度和血管内皮细胞增生与上皮组织的关系. 应用血管内皮细胞生长因子(VEGF)和增生细胞核抗原(PCNA)标记增生的上皮细胞. 探讨肿瘤形成过程中血管内皮细胞增生和肿瘤形成的关系.

　　1　材料和方法

　　MNNG为Sigma公司产品，纯度99%，储存4℃冰箱内. 将MNNG黄色晶体溶解于蒸馏水中，使其成为300mg/L母液，用时加等量4g/L吐温20水溶液，配成150mg/L溶液，供大鼠自由吸饮. 饲料中添加Vit D₃，将其与饲料均匀混合，使其浓度达2.5和5.0mg/kg. 实验用Wistar雄性大鼠150只(由白求恩医科大学实验动物中心提供)，随机分4组. 实验组每组40只，对照组每组30只，Ⅰ组为对照组自由吸饮蒸馏水，进食常规饲料；Ⅱ组大鼠自由吸饮MNNG+吐温20水溶液，进常规饲料；Ⅲ和Ⅳ组除自由吸饮MNNG+吐温20，在饲料中分别添加Vit D₃(2.5和5.0mg/kg). 实验组8，16，24wk分别处死大鼠7只，余下鼠32wk全部处死. 每组取3只大鼠在乙醚麻醉下经主动脉灌注墨汁，观察血管与间质组织的变化. 胃沿大弯侧剪开，同其他脏器固定于100ml/L中性福尔马林溶液中. 血管密度按Bosars方法计数3个血管最高区，取其平均值.

　　2　结果

　　实验8wk，3个实验组，显微镜下观察到的组织形态相同，腺胃粘膜呈显炎性改变，局部粘膜基底部有大量嗜酸性白细胞浸润. 16wk各实验组大鼠前胃和腺胃组织形态学有明显差异，MNNG+吐温20组，腺胃粘膜发生重度糜烂，上皮缺损(图1). 前胃和腺胃粘膜层粘膜下层和肌层血管密度有不同程度增多，血管牙生，血管内皮细胞开始增生(图2). 24wk实验组大鼠前胃和腺胃间质组织中血管内皮细胞增生更明显，表现为血管阻塞，粘膜供血减少，组织变性，粘膜脱落变薄，腺体减少或萎缩，MNNG+Vit D₃组无论前胃还是腺胃均可见原位癌发生(图3). 血管密度：每组取3只大鼠，每只观察3个高倍视野计数血管平均值，表1.

　　表1　间质组织中血管密度比较

　　^*3个高倍视野血管断面平均值.

　　实验组大鼠前胃、腺胃肿瘤发生率32wk均有不同程度增加，以MNNG+Vit D(5.0mg)组的发生率最高，该组处死的20只大鼠中， 发生原位癌和浸润癌共16只，占80.0%，有的大鼠前胃和腺胃同时发生癌变(表2).

　　表2　MNNG诱发大鼠胃癌统计表

　　每组以10只大鼠前胃、腺胃组织进行VEGF和PCNA免疫组织化学染色，4组间均有不同阳性反应，对照组大鼠PCNA仅限于个别细胞核染阳性，实验组大鼠增生的上皮细胞PCNA阳性率为62.3%. 增生的血管EC被VEGF染阳性，阳性率为71.2%(图4，5)，对照组大鼠血管EC染阴性.

　　图1　16wk大鼠胃粘膜糜烂，炎细胞浸润 HE×100

5　增生的血管EC，VEGF免疫组化染阳性　×200

　　3　讨论

　　血管的增殖是组织生长发育所必须的一个过程，而成年大鼠除了组织损伤修复过程中可以见到血管的增殖外，其他组织很少发生血管新生，特别是血管内皮细胞的增生更少见. 另外组织损伤修复期血管新生是短暂的，并受机体严格调节. 与之相反，在某些病理性疾病中，常发生无控制血管生成. 在观察大鼠胃癌形成、发展过程中，血管新生和血管内皮细胞增生是肿瘤形成的最大特点，是不受机体控制的. 本组大鼠诱癌实验证实，肿瘤形成之前，首先是血管的新生、血管内皮细胞增生，增生的内皮细胞阻塞血液流通，引起部分组织缺氧，细胞变性等一系列病理性变化.

　　本组动物实验进行到8wk时，大鼠前胃和腺胃粘膜层、粘膜下层血管新生，主要是微血管增多，血管以芽生和窦样扩张为主. 16wk在血管新生的基础上，血管内皮细胞开始增生. 这些增生的内皮细胞，如前所述对机体的控制失灵，无限度增殖，组织损伤修复期血管新生受机体严格控制，一旦组织恢复正常血管增生很快停止. 显微镜下血管内皮细胞主要表现以增生为主、血管腔狭窄，有的见血栓形成. 此期胃粘膜组织糜烂、局限性上皮缺损，并伴有以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞浸润. 经动脉灌注墨汁可见，实验组大鼠前胃和腺胃血管密度比对照组大鼠高几十倍，以MNNG+Vit D₃组为重. 在血管内皮细胞增生的基础上，导致局部组织供血减少，使细胞长期处于低氧状态下生存，这种环境更适合肿瘤的发生、发展，因而引发细胞突变，这一观点应进一步研究.

　　实验组大鼠另一特殊的改变是，无论前胃还是腺胃一旦肿瘤形成，从肿瘤的中心部位开始血管的密度逐渐减少，乃致消失. 而肿瘤外周仍然可见大量血管新生和血管内皮细胞增生，与肿瘤中心血管密度形成鲜明对比. 肿瘤外带血管密度越高，血管内皮细胞增生的越明显，血管腔阻塞的越重，肿瘤细胞生长的越活跃. 实验组大鼠应用VEGF免疫组化对增生的内皮细胞标记的阳性率仍然高于对照组. 这一反应说明血小板源生长因子除了特异的刺激血管内皮细胞增生外，还具独特的促使血管通透性增强的作用^［4］. 但是促使内皮细胞增生的机制尚不清楚，应进一步研究.

　　根据报道饲料中添加Vit D₃对化学致癌剂诱发动物肿瘤有抑制作用^［5］. 特别是对动物的乳腺癌、皮肤癌有明显的抑制作用^［5，6］，有人指出无论体内还是体外实验均可抑制多种癌细胞的生长^［7］. Vit D₃对大鼠胃癌的发生，是否也有预防作用，尚未见报道. 该实验添加Vit D₃旨在降低实验组大鼠胃癌发病率，但是最终结果表明，Vit D₃不但没有起到预防大鼠胃癌的发生，反而加速实验组大鼠胃癌的形成^［8，9］. 24wk时可见Vit D₃组大鼠发生原胃癌，32wk时处死的MNNG+Vit D₃(5.0mg)组的20只大鼠中，前胃和腺胃发生原位癌和浸润癌的有16只，占80.0%. 肿瘤发生的时间由报道的365d～450d缩短到168d(24wk)，有的大鼠前胃和腺胃同时发生癌瘤. 从肿瘤的发生率表明，Vit D₃在诱发大鼠胃癌过程中，有剂量相关和时间相关的作用，这是因为胃粘膜组织中的Vit D₃受体比较少. 另一方面Vit D₃即可以靶向肿瘤细胞，也可以靶向血管内皮细胞，因此MNNG与Vit D₃合用可以加速血管内皮细胞增生，促进肿瘤形成等作用.

　　高国林，男，1952-08-03生，辽宁省彰武县人，汉族. 1975年于大连军医学校毕业，现任解放军222医院消化实验室主管技师，发表医学论文50篇，获军队科技进步奖5项.

　　通讯作者　高国林，132011，解放军222医院消化实验室，吉林省吉林市越山路18号.

　　Correspondence to: Dr. GAO Guo-Lin, Gastroenterology Laboratory, Chinese PLA 222 Hospital, 18 Yueshanlu, Jilin 132011, Jilin Province, China

　　Tel. +86*432*2059626

　　收稿日期　1997-09-02　修回日期　1997-09-30

　　4　参考文献

　　1　高国林，潘伯荣，杨思凤. 血管内皮细胞第Ⅷ因子在胃癌间质血管的研究. 新消化病学杂志，1994；2(1)：30-32

　　2　张宗显，李玉琼，孙振贤. 表面活性剂对MNNG诱发消化道肿瘤的影响. 中华病理学杂志，1986；15(1)：6-7

　　3　刘燕平，朱少侠. 去势对MNNG诱发大鼠腺胃腺癌的影响. 中华病理学杂志，1989；18(2)：128-130

　　4　Reichel H, Koeffler HP, Norman AW. The role of the vitamin D₃ endocrine system in health and disease. New Eng J Med, 1989;13(4):980-991

　　5　Bosari S, Lee KC, Delellis RA. Mcrovessel quantiication and prognosis in invasive breast carcinoma. Hum Pathol, 1992;23(3):755-761

　　6　Wood AW, Chang RL, Huang MT. 1,25-dihydroxyvitamin D₃ inhibits phorbol ester-depndent chemical carcinogenesis in mouse skin. Biochem Biophys Res Commun, 1983;116(3):605-611

　　7　Majewskisi S, Szmurlo A, Marczak M, Inhibition of tumor cell induced angiogensis by retinoids; 1,25-dihydroxyvitamin D₃ and their combination. Cancer Lett, 1993;75(1):35-41

　　8　Wood AW, Chang RL, Huang MT, Stimulatory of 1,25-dihydroxyvitamin D₃ effect on the formation of skin tumors in mice treated chronically with 7, 12-dimethylbenzanthracene. Biochem Biophys Res Commun, 1985;130(2):924-931

　　9　Toshio K, Kiyoshi S, Kazuhiro C, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ markedly enhances chemically-induced tranformation in BALB 3T3 cells. Gann, 1983;74(5):611-614