急性白血病患者p53和bcl-2表达的临床意义

　　第二军医大学学报2000年第21卷第3期

许小平　史剑慧　程文英　罗伟华　王健民　闵碧荷　丁训杰

　　摘　要　目的：探讨急性白血病患者骨髓细胞p53，bcl-2基因表达水平与化疗预后的关系。方法：用免疫组化法测定了42例急性白血病初发患者的骨髓细胞p53，bcl-2表达水平，并分析随访组(27例)两者表达水平与化疗预后的关系。10例血液系统良性疾病患者作为对照。结果：42例患者p53和bcl-2总体表达水平显著高于对照组。在27例可随访疗效的急性白血病患者中，p53，bcl-2均为阳性者完全缓解（CR）率低，p53及 bcl-2均为阴性者CR率高。结论：检测急性白血病患者骨髓细胞的p53和 bcl-2基因表达水平有助于预测化疗疗效。

　　关键词：白血病,急性；基因，p53；基因， bcl-2；预后

　　一些研究已发现某些恶性肿瘤的发生、发展及预后与凋亡密切相关。大部分抗肿瘤药物的作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡。部分肿瘤细胞对化疗药物产生耐受，可能与细胞内某些与凋亡相关的基因表达改变有关。野生型p53和bcl-2分别是与血液系统恶性肿瘤细胞关系最为密切的凋亡诱导和拮抗相关基因。为探索急性白血病患者p53，bcl-2表达与临床化疗疗效之间的关系，我们检测了42例初治急性白血病患者骨髓细胞p53和bcl-2基因的表达，对其中27例住院患者结合临床化疗结果进行分析。现将资料报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料　42例初发急性白血病患者来自本院血液科和上海医科大学华山医院血液科。随访组27例，男14例，女13例,中位年龄44岁（14～70岁）。按FAB分型标准，急性髓细胞白血病（AML）18例，其中M₁1例、M₂ 9例、M₃ 1例、M₄ 4例、M₅2例、M₇　1例；急性淋巴细胞白血病（ALL） 9例。失随访组15例，其中AML9例，ALL 6例。以上所有患者均经形态学、细胞化学及免疫组化确诊。另有10例血液系统良性疾病（特发性血小板减少性紫癜6例，缺铁性贫血4例）患者作为对照。

　　1.2　化疗方法　AML治疗采用HA（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷）、DA（柔红霉素、阿糖胞苷）方案。ALL采用VDCP（长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、强的松）或VDP（长春新碱、柔红霉素、强的松）方案治疗。完全缓解（CR）和未缓解（NR）判别按国内现行标准。

　　1.3　标本制备　抽取骨髓，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液（上海试剂二厂生产）分离出单个核细胞（20℃，1500 r/min，20 min），细胞悬液以含小牛血清的RPMI-1640培养液（日本株式会社生产）洗涤2次备用。细胞离心涂片，白血病细胞比例≥0.70。

　　1.4　p53 和bcl-2表达检测　以L-多聚赖氨酸（上海华美公司）预先涂布玻片。细胞涂片（细胞密度为2×10⁶个/ml）后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。用正常血清短暂作用后加p53和bcl-2单抗，所用单抗p53（DO-7）和bcl-2（124）购自上海华美公司（系丹麦DAKO公司产品）。37℃湿盒作用30 min,加生物素化二抗室温作用10 min,加辣根酶标记链霉亲和素工作液（Streptavidin/HRP）室温作用10 min,最后以DAB(即用型HRP-DAB药盒购自美国Labvision公司)染色。细胞核（p53）或细胞质（bcl-2）被染成黄棕色为阳性细胞。计数1000个细胞中的阳性细胞，检测结果以阳性细胞百分率表示。

　　1.5　统计学处理　实验数据分析采用两样本均数比较的t检验及t′检验。

　　2　结　果

　　2.1　急性白血病患者化疗前骨髓细胞p53，bcl-2表达水平　白血病患者免疫组化检测p53阳性显示细胞核染成黄棕色，bcl-2阳性则细胞质染成黄棕色(图1)。化疗前p53表达检测结果：AML组、ALL组及对照组分别为(19.1±14.4)%,(23.0±13.8)%,(8.2±4.7)%。bcl-2表达检测结果：AML组、ALL组及对照组分别为(28.9±17.1)%，(29.0±15.8)%，(10.6±10.8)%。经统计学处理，AML组和ALL组，化疗前p53和bcl-2表达水平均显著高于对照组(均P＜0.05）。

　　2.2　不同预后的急性白血病患者p53，bcl-2表达水平比较　化疗后随访检测结果(表1)，表明CR之AML患者化疗前骨髓细胞p53及bcl-2表达均低于NR者，两者有显著性差异。ALL患者在CR与NR者之间化疗前骨髓细胞bcl-2表达亦存在显著性差异。

　　2.3　急性白血病患者化疗疗效与p53,bcl-2表达关系　参照对照组p53和bcl-2表达水平，以p53表达＞10％为p53阳性结果，≤10％为p53阴性结果；bcl-2则＞15％为bcl-2阳性结果，≤15％为bcl-2阴性结果，则27例急性白血病患者化疗缓解率与p53和bcl-2表达的关系见表2。

图1　白血病患者p53，bcl-2检测结果

　　fig 1　Detection of p53 and bcl-2 in the patients with acute leukemia

　　a: Expression of p53 in a patient with AML; B: Expression of bcl-2 in a patient with ALL

表1　CR与NR患者p53，bcl-2表达水平比较

　　tab 1　Comparison of expression of p53 and bcl-2 between patients with CR and nR(±s,%)

　　P＜0.05 vs CR patients

表2　p53和 bcl-2表达与化疗疗效的关系

　　tab 2　The relationship between expression of p53

　　and bcl-2 and results of chemotherapy

　　表2结果提示无论AML或ALL，p53阳性、bcl-2阳性者CR较少；p53阴性、bcl-2阴性者均获CR；而p53阴性、bcl-2阳性时5例中3例未获缓解，提示bcl-2的表达水平与疗效关系似更密切。

　　3　讨　论

　　野生型p53基因是一个肿瘤抑制基因，它编码一种相对分子质量为5.3×10⁴的磷酸化核蛋白，该蛋白作为一种转录因子可以通过调控与细胞增殖有关的基因如mdm2，waf-1，bcl-2和bax来调节细胞凋亡。当p53基因外显子5-8区域发生某种突变时，表达产物就丧失抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能。原癌基因bcl-2定位于18号染色体臂2区1带，它的生理功能主要通过阻遏细胞凋亡而延长细胞的生存时间。很多血液系恶性肿瘤细胞bcl-2都表达增强^［1］。

　　许多抗肿瘤药物被认为能够诱导肿瘤细胞的凋亡，bcl-2不仅能阻遏化疗药物引发的肿瘤细胞的凋亡，而且也能拮抗野生型p53诱导的细胞凋亡，而突变后的p53基因本身也丧失了诱导细胞凋亡的功能。因此，bcl-2的高表达及p53基因突变与化疗药物的疗效存在一定的关系^［2,3］。由于野生型p53的半衰期仅为30 min,而突变的p53则半衰期明显延长，故采用免疫组化方法检测阳性的p53，相当于突变的p53^［3］。林凤茹等^［4］用流式细胞仪检测发现37例AML中81.1％ p53阳性，而9例ALL则全部p53阳性。我们用免疫组化法测得对照组p53为(8.2±4.7)％，bcl-2为(10.6±10.8)％,而初发急性白血病患者的p53和bcl-2表达均显著高于对照组，提示p53和 bcl-2的突变与急性白血病的发病有密切关系。通过对27例随访组患者的观察还发现，患者化疗前骨髓细胞p53，bcl-2的表达水平与预后存在着一定的联系，高表达p53或 bcl-2均可能是造成化疗药物原发性耐药的重要因素。Wattel等^［5］报道的资料显示，一组AML患者中p53突变者仅有33％能获得CR，而无p53突变则CR率为81％。在CLL组有 p53突变者，化疗CR率为12.5％，而非突变者为80％。Borg等^［6］分析50例经过强烈化疗的AML患者后发现高表达bcl-2与其低CR率相关。Uckun等^［7］在研究了338名儿童ALL患者bcl-2表达后发现，在T-ALL中bcl-2高表达者治疗28 d仍未达到缓解。我们的资料表明急性白血病的bcl-2，p53共同阳性的患者，化疗效果差；而p53，bcl-2共同阴性者CR率高，且bcl-2阳性的意义似比p53阳性的意义更为重要。根据以上结果，我们认为，检测初治急性白血病患者骨髓细胞p53和bcl-2表达水平对于预后预测具有一定的价值。■

　　基金项目：上海市科技发展基金资助项目（944512006）

　　作者简介：许小平（1960-），男（汉族），博士，副教授

　　许小平（第二军医大学长海医院血液科，上海200433)

　　王健民（第二军医大学长海医院血液科，上海 200433)

　　闵碧荷（第二军医大学长海医院血液科，上海 200433)

　　史剑慧（上海医科大学放射医学研究所)

　　程文英（上海医科大学放射医学研究所)

　　罗伟华（上海医科大学放射医学研究所)

　　丁训杰（华山医院血液学研究室）

　　参考文献

　　［1］　Thomas a, El-Rouby S, Reed JC, et al. Drug-induced apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia: relationship between p53 gene mutation and bcl-2／bax proteins in drug resistance［J］. Oncogene, 1996,12(5):1055-1062．

　　［2］　Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy［J］. Blood, 1993, 82(1):15-21．

　　［3］　Herris CC, Hollstein M. Clinical implication of the p53 tumor suppressor gene［J］. N Engl J Med, 1993, 329(18): 1318-1327．

　　［4］　林凤茹, 张学军, 郭晓楠, 等.流式细胞术研究急性白血病患者p53和bcl-2表达与凋亡的临床意义［J］.综合临床医学, 1997,13(5):428-430．

　　［5］　Wattel E, Preudhomme C, Hecquet B, et al. P53 mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignancies［J］. blood, 1994, 84(9):3148-3157．

　　［6］　薛红漫, 李文益. Bcl-2与白血病耐药［J］. 国外医学*输血与血液学分册,1999, 22(2):79-82．

　　［7］　Uckun FM, Yang ZW, Sather H, et al. Cellular expression of antiapoptotic bcl-2 oncoprotein in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia : a children′s cancer group study［J］. Blood, 1997,89(10):3769-3777．