术中高强度超声治疗晚期实验性肝癌

中华超声影像学杂志 1999年第4期第8卷 实验研究

作者：孔凡斌　伍烽　白晋　王芷龙　王文见　阮祥燕　王智彪

单位：400046　重庆医科大学医学超声工程研究所

关键词：超声疗法；术中高强度超声；肝肿瘤；实验性

　　【摘要】　目的　评价术中高强度超声(IHIU)治疗晚期种植性兔肝脏VX₂肿瘤的有效性。方法　26只实验动物分为四组： A组为对照组，B组接受阿霉素(3 mg/kg)治疗，C组接受IHIU治疗，D组接受IHIU和阿霉素(3 mg/kg)治疗。IHIU声强为45.86 W/cm²，频率10 MHz，作用时间1 200秒，治疗范围包括肿瘤周围0.2 cm的肝组织。记录各荷瘤兔的生存时间和各组兔的治愈率，定期检查各兔的肝肾功能。结果　与对照组比较，各实验组荷瘤兔的生存时间明显延长(P＜0.05)；接受IHIU和阿霉素治疗的荷瘤兔(D组)的生存时间明显长于单独接受阿霉素治疗组(B组)(P＜0.05)。各组荷瘤兔的治愈率分别为A组0、B组0、C组16.67%、D组33.33%，提示IHIU组、IHIU加化疗组的治愈率有升高趋势。结论　IHIU能有效地治疗晚期兔肝VX₂肿瘤，IHIU与阿霉素合用疗效明显增加。IHIU可能成为一种治疗晚期肝癌的新疗法。

　　Intraoperative high intensity ultrasound in the treatment of

　　advanced experimental liver cancer

KONG Fanbing,WU Feng,BAI Jin,et al.Institute of Ultrasonic Engineering in Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016

　　【Abstract】 Objective To evaluate the efficacy of intraoperative high intensity ultrasound (IHIU) in the treatment of advanced stage rabbit VX₂ cancer implanted in the liver.Methods Twenty-six rabbits with liver tumors were divided into four groups.Group A(n=7) did not receive therapy; group B (n=6) received adriamycin (3 mg/kg) via the marginal ear vein; group C (n=7) received 1 200 s IHIU sonication at the acoustic intensity 45.86 W/cm²,with an operating frequency of 10 MHz,the extension for ultrasound beam ablation was set to extend 0.2 cm beyond the visable tumor margin; group D (n=6) received adriamycin (3 mg/kg) and IHIU therapy (the same parameters as in group C).The survival time of each rabbit and the cure rate of each group were racorded.Liver and renal functions were examined at predetermined times (20,22 and 28 days after implantation).Results Compared with the group that didn't receive therapy,the groups that received therapy survived significantly longer.The rabbits that received both adriamycin and IHIU in group D survived significantly longer than that in group B receiving adriamycin only (P＜0.05).The cure rates in every group are that: in group A is zero,in group B is zero,in group C is 16.67% and in group D is 33.33%.It suggests that the cure rates in group C and in group D have a trend of ascension.Conclusions IHIU can effectively treat advanced stage rabbit VX₂ cancer in liver,when IHIU and adriamycin is given as a combined therapy,it will enhance the efficacy obviously.IHIU may be a new and useful method for local treatment of hepatic tumors.

　　【Key words】 Ultrasonic therapy Intraoperative high intensity ultrasound Liver neoplasms,experimental

　　肝癌的治疗首推手术切除。但对晚期肝癌，因肿瘤较大，多发结节并常伴有肝硬化、肝功能不全等而无法手术，故局部非手术疗法更为重要。近年来，临床应用的酒精注射、激光、射频、微波等局部疗法，取得了一定的疗效，但它们都需在肝癌组织内插入穿刺针，治疗范围不易控制，对较大的肿瘤治疗较困难，临床应用有很大局限性^［1，2］。术中高强度超声(intraoperative high intensity ultrasound，IHIU)是一种局部高温治疗肿瘤技术，本研究探讨IHIU治疗晚期种植性兔肝脏VX₂肿瘤的有效性。

　　材料与方法

　　一、IHIU治疗机

　　由本课题组设计、制造。该机包括功率发生源、治疗探头、循环水降温系统三个部分。治疗探头发出的声波为非聚焦平面高强度超声波，平均声强为45.86 W/cm²，频率10 MHz，治疗时，手持探头对靶区进行治疗。治疗所用超声声强经过检测^［3］。

　　二、兔肝肿瘤模型的制作

　　纯种新西兰大白兔(重庆医科大学实验动物中心提供)26只，雌雄不分，体重2～3 kg，月龄3～4月，VX₂肿瘤细胞株(由日本京都Funabshi Farm 公司馈赠)具有较强的转移性，能在兔身体的不同部位生长，能制成可靠的兔肝癌模型^［2］。实验时，先将复苏的VX₂肿瘤细胞0.5×10⁶个接种于兔后腿外侧肌肉内，2周后可扪及一实质性包块，即制成荷瘤种兔。切取该包块边缘生长旺盛的鱼肉样组织块，制成1 mm³瘤块，置于低温RPMI-1640培养液中。用8%Na₂S将兔腹部脱毛，3%戊巴比妥钠1 mg/kg将兔麻醉后，把兔固定于固定架上。于兔上腹部剑突下约0.2 cm处作一横切口，长约2.5 cm，暴露肝脏，将肝左前叶牵出体外，在距其下缘约1.5 cm处用11号刀片作一小切口。纱布压迫止血后，用眼科镊将上述1 mm³的肿瘤块植入并缝合切口，肝叶放回腹腔，依次缝合切口。于种植后21天可形成一直径2.0～3.0 cm的肿瘤，并出现肺部转移灶，肿瘤接种成功率100%。

　　三、实验分组

　　将接种了VX₂肿瘤的26只新西兰大白兔随机分为A组(对照组)7只、B组(阿霉素治疗组)6只、C组(IHIU治疗组)7只、D组(IHIU和阿霉素治疗组)6只。

　　四、IHIU的照射治疗

　　C、D两组兔，于接种肿瘤后21天，经耳缘静脉用3%戊巴比妥钠1 mg/kg将兔麻醉并将其仰卧固定于手术台上。经原切口切开腹壁，把埋植肿瘤的左前叶肝拉出切口外，为防止超声波损伤皮肤和内脏，把一小块干纱布置于肝脏与切口皮肤之间，用生理盐水保持靶区肝组织表面湿润，将消毒后的探头置于肝脏表面，轻轻施压，对肿瘤行先周边后中心的治疗，治疗范围包括肿瘤及其周围0.2 cm的肝组织，每次治疗时间为30秒，每次治疗重叠1/5，每个肿瘤灶分别从肝叶膈面和脏面进行治疗。在治疗的13只兔中，有4只肝内探测到直径约0.3 cm的转移结节，对其一并治疗。每只兔治疗时间约1 200秒，损伤体积为15～20 cm³，A、B两组剖腹后假照，治毕关腹。将兔送回动物房饲养。

　　五、实验设计

　　将阿霉素稀释到1 mg/ml，以1 mg/kg的剂量分别于种植后20、21、22天经兔耳缘静脉给予，总剂量为3 mg/kg。具体治疗设计见表1。

　　六、标本收集

　　在种植肿瘤后20、22、28天经兔耳缘静脉采血，检验兔血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。于种植肿瘤后21天，从A组中任选一只兔处死，切下肝脏肿瘤组织及肺部转移灶；从C组中任选一只，于治疗即刻切下肿瘤组织及肺部转移灶。切下的组织，置于10%甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色。记录每只动物的生存时间，存活超过150天，病理切片未发现肿瘤复发或转移者，视为治愈。

　　七、统计学分析

　　各生化检查的比较用t检验，生存时间的分析用Log-rank法，用四格表概率确切计算法比较各组荷瘤兔的治愈率，绘制各组荷瘤兔的精确生存曲线，P＜0.05有统计学差异。

　　结　果

　　一、病理学观察

　　于接种肿瘤21天，剖腹发现26只兔的肝脏内皆有直径2.0～3.0 cm的肿瘤结节，9例肝内有肉眼可见的转移结节，处死的2例肺内都发现结节样转移灶。组织切片显示： 未经治疗的肿瘤灶呈浸润性生长，与肝实质互相交织，癌细胞呈巢样或不规则排列，癌细胞体积大、染色深，胞浆少，核大呈圆形或椭圆形(图1)。治疗即刻，可见肿瘤灶周围肝血窦破裂出血，肝细胞核浓缩；癌组织间隔增宽，癌细胞胞体固缩，核多浓缩变形，染色深浅不一(图2)。肺内可见结节样转移灶，癌细胞形态与上述同，排列呈巢样或不规则样(图3)。

1　种植后21天的兔肝脏VX₂肿瘤(HE染色 100×)下方的肿瘤组织向上

　　方的肝组织内浸润生长，二者互相交织，癌细胞呈巢样或不规则排列，

　　癌细胞体积大，染色深，胞浆少，核大呈圆形或椭圆形

2　种植后21天的兔肝脏VX₂肿瘤治疗即刻(HE染色 100×)左侧为肿瘤组织，

　　可见癌组织间隙变宽，癌细胞胞体固缩，核多浓缩变形，染色深浅不一；

　　右侧为肝组织，近肿瘤灶肝血窦破裂出血，肝细胞体固缩，核浓缩

3　种植后21天兔肝脏VX₂肿瘤肺转移灶(HE染色 100×)　左侧为肿瘤转移灶，

　　癌细胞呈巢样或不规则排列，癌细胞体积大，染色深，胞浆少，核大呈圆

　　形或椭圆形；右侧为肺组织

　　二、肝、肾功能变化

　　接种肿瘤后20天，即IHIU治疗前1天，各组间肝、肾功能化验结果无差异；IHIU治疗后1天，C、D两组荷瘤兔的AST、ALT较A组明显升高(P＜0.01)；治疗后7天，各组间的各项化验结果无差异。

　　三、生存时间和治愈率

　　除治愈者外，荷瘤兔的死因皆为肿瘤肺转移或全身衰竭，未发现与治疗有关的死亡。A、B、C、D四组荷瘤兔的平均生存时间分别为42.5、72、75、91.5天，B、C、D组荷瘤兔的生存时间较A组明显延长(P＜0.05)，D组较B组生存时间延长(P＜0.05)，其余组间未发现差异。A、B、C、D四组荷瘤兔的治愈率分别为0(0/6)、0(0/6)、16.67%(1/6)、33.33%(2/6)，C、D两组的治愈率较A、B组高，但各组间的治愈率未发现差异。

　　讨　论

　　晚期肝癌伴肝硬化、肝功能不全的患者及术后复发、转移性肝肿瘤患者，手术切除非常困难，故局部非手术疗法就显得更为重要。近年来，酒精注射、激光、射频、微波等局部疗法已应用到临床，但它们都需穿刺肝肿瘤组织，增加了针道转移、出血、胆漏的危险，且治疗时间较长，需反复应用，治疗过程缺乏有效的监控，不能确保将肿瘤完全破坏，临床应用有一定的局限性^［4-6］。IHIU是一种局部高温治疗肿瘤的新技术，它利用超声波的组织穿透性，通过其热效应，机械效应、特别以空化效应直接破坏靶区组织。在其它实验中，我们观察到靶区温度达85℃，这足以使靶区的肿瘤及肝组织发生热凝固性坏死；10 MHz声强45.86 W/cm²的治疗探头治疗30秒，组织凝固性坏死的深度可超过2.0 cm，故本实验中所用的治疗方式足以破坏整个肿瘤灶。与其它局部疗法相比，IHIU不需要介入肿瘤内，具有方向性，在组织内分布均匀，可一次性将靶区组织完全破坏达到对晚期肝VX₂肿瘤有效治疗的目的。

　　实验中所用的VX₂肿瘤细胞株具有浸润性生长、转移等特点。与文献报道^［2］相似，我们观察到将1 mm³的该肿瘤块种植到兔肝内，3周后肺内出现转移灶，因有远处器官的转移故为晚期肝癌。对于兔VX₂肿瘤治愈的标准，尚未见报道，参照Prat及Alexander的实验，他们认为荷VX₂肿瘤兔生存超过4个月就已是比较长的时间^［2，8］；Chapelon在用前列腺腺癌Dunning R₃₃₂₇的AT₂细胞株进行的实验中，认为荷瘤鼠生存时间超过115天，病理检查未发现肿瘤复发及转移即为治愈，而该细胞株亦具有转移性，荷瘤鼠的自然生存时间为7～8周，与VX₂肿瘤相似^［9］。参照这些实验，我们认为荷VX₂肿瘤兔存活超过150天，且病理学证实无肿瘤复发及转移，即可认为治愈。

　　从本实验的结果看，IHIU治疗晚期兔肝VX₂肿瘤是有效的，IHIU与化疗合用的疗效明显优于化疗，其机理有待进一步探讨。本实验发现C、D两组中有3例晚期兔肝癌被治愈，可能是由于IHIU在破坏局部肝癌的同时，也刺激机体的免疫系统，诱发机体的抗肿瘤免疫，从而消除远处转移灶，对此尚待进一步研究。本实验中未发现IHIU对机体产生明显的毒副作用，其对肝功能的影响与超范围破坏肿瘤病灶有关，该治疗范围包括肿瘤病灶和距肿瘤边缘0.2 cm以上的正常肝组织，而且肝酶谱的变化只是暂时的、可复性的。

　　本研究结果表明： IHIU治疗晚期兔肝癌是有效的，与其它局部疗法相比具有较多的优越性。随着低频率、高声强治疗探头的应用，其组织穿透性将会进一步提高，该技术有望成为临床治疗肝癌的新疗法。

　　本课题获“九五”国家科技重点攻关项目资助(资助号：96-905-02-01)

　　参考文献

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(收稿　1999-05-18)