外周血单个核细胞甲胎蛋白mRNA表达与肝癌的研究
肿瘤 1999年第6期第19卷 论著
作者：罗 伟 王 红 王 强 矢野右人
单位：罗伟 王红 王强 上海第二医科大学医学检验实验室(上海200023)；矢野右人 日本国立长崎中央病院临床研究部
关键词：甲胎蛋白；肝肿瘤/诊断；外周血单个核细胞；肿瘤转移/诊断
中图分类号：R735.7 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0323-04
摘要：目的 应用RT-PCR技术研究原发性肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)甲胎蛋白(AFP)mRNA表达与肝癌转移的关系。方法 原发性肝癌48例。慢性肝病患者21例。正常对照20例。采外周血，肝素抗凝，分离单个核细胞及分离总RNA。逆转录酶合成cDNA。设计扩增AFP基因的引物，进行巢式PCR扩增。结果 正常人PBMC均无AFP mRNA表达。原发性肝癌患者的PBMC AFP mRNA阳性率(28/48，58.33%)明显高于慢性肝病组(3/21，14.28%，P＜0.01)。伴远处转移的原发性肝癌患者全部为阳性(8/8)。结论 RT-PCR检测原发性肝癌患者AFP mRNA有可能成为反映肝癌细胞血行播散的指标。
EXPRESSION OF AFP mRNA IN PERIPHERAL BLOOD CELLS OF PATIENTS WITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA
LUO Wei1，WANG Hong1,WANG Qiang1,et al.
(1Laboratory of Medical Technology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200023,China；2Clinical Research Branch,National Nagasaki Central Hospital,Japan)
Abstract：Objective A nested reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) was developed to study the relationship between expression of AFP mRNA in peripheral blood mononuclear cells and metastasis in patients with hepatocellular carcinoma(HCC).Methods Heparinized blood samples were obtained from 48 patients with HCC,21 patients with chronic liver diseases and 20 normal subjects.Mononuclear cells were separated from blood.Total RNA was extracted by the acid-guanidium-phenol-chloroform method.The first strand of cDNA was synthesized from an aliquot of the RNA using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and random hexamers.The two pairs of primers chosen from the sequences of AFP were used for the two-step PCR.Results AFP mRNA in peripheral blood cells was not detected in all normal subjects, but it was detecte in 28 of 48 (58.33%) cases with HCC and in all 8 patients with extrahepatic metastasis.The positive rate in patients with HCC was significantly higher than the cases with chronic liver diseases(3/21,14.28%,P＜0.01).Conclusions The detection of AFP mRNA in peripheral blood cells may be helpful for clinial detection of metastasis of HCC.
Key words：α-fetoprotein ；Liver neoplasms/diagnosis；Peripheral blood mononuclear cells；Neoplasm metastasis/diagnosis
血行转移是恶性肿瘤常见的病理特征，肿瘤的血行播散是转移发生的重要条件，及时发现血流中的肿瘤细胞对于治疗方案的选择，预后的判断，疗效观察有重要价值。
近来有文献报道用肿瘤特异基因反映血流中肿瘤细胞的存在。例如通过检测外周血角蛋白基因来判断结肠肿瘤细胞的骨髓转移和血源性播散［1，2］以及前列腺特异抗原mRNA提示前列腺癌细胞的血源性播散［3］。甲胎蛋白是目前肝癌特异的生物标志物，在外周血细胞中不能检测到甲胎蛋白基因［4］。唯有在肝癌细胞脱落于血液中才能得以检测。因此，甲胎蛋白mRNA是一项比较好的血源性肝癌细胞的观察指标。
本文报道用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)作外周血甲胎蛋白mRNA表达与肝癌转移的相关性研究。
材料与方法
1.研究对象 原发性肝癌48例，男性30例，女性18例，年龄43～85岁，平均65岁。经CT、核磁共振等影像学检查确诊，其中伴远处转移者8例。病理分期TNM Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期26例。慢性肝癌患者21例(肝硬化12例，慢性肝炎9例)及正常对照20例。
2.标本制备 每位受试者抽取10 ml静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心分离得外周血单个核细胞(PBMC)，用1 ml GTC混合(4 mol/L硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1 mmol/L 2-巯基乙醇)置-80℃保存。取200 μl细胞GTC混合液(相当于2 μl全血)，采用异硫氰酸-酚-氯仿一步法分离总RNA［5］。用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(GIBCO BRL)和随机引物以20 μl总体积37℃温育90 min合成cDNA。
3.巢式PCR 选择5′-GAAGACAGGGAGACATTCAT-3′和5′-GGTAAACTTCTGACTCAGTT-3′和5′-GAAAGTTCGGGTCCCAAAAT-3′(外引物对)，5′-ATGAGATAGCAAGAAGGCAT-3′和5′-GAAAGTTCGGGTCCCAAAAT-3′(内引物对)作为扩增AFP基因的引物［6］。5′-CATGAAGTGTGACGTGGACATCC-3′和5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAAGG-3′作为扩增β-肌动蛋白基因的引物［7］。β-肌动蛋白基因的扩增作为实验的质控。10 μl cDNA和40 μl PCR反应液混合(含100 μmol/L dNTP,25 pmol外引物，1 U TaqDNA聚合酶)，在DNA扩增仪(Perkin Elmer Cetus 9600)循环扩增，94℃变性5 min，然后进入35次温度循环(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)，最后延伸7 min。取第一轮扩增产物5 μl作第二轮扩增，扩增条件同第一轮。对同一cDNA作β-肌动蛋白基因扩增，扩增条件同AFP基因扩增。
4.扩增产物鉴定 取扩增产物5 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外光下观察结果。AFP基因和β-肌动蛋白基因的扩增产物分别是215 bp和229 bp。
5.血清AFP测定 采用酶联免疫法测定血清AFP。试剂为日本Dainabot公司产品。
6.统计 采用χ2检验。
结果
1.PBMC AFP mRNA的表达
PBMC AFP mRNA表达(见图1)。第一次扩增无条带出现，第二次扩增后可在215 bp处发现条带。
图1 外周血单个核细胞AFP mRNA RT-PCR结果
1：正常对照；2，3：肝癌；4，5：良性肝病；
6：肝癌伴远处转移；7：Marker
实验结果显示，正常人PBMC均无AFP mRNA表达，原发性肝癌和慢性肝病患者PBMC AFP mRNA阳性率分别为58.33%(28/48)和14.28%(3/21)。两者有显著差异(P＜0.01)。
表1 各组PBMC AFP mRNA的表达
| 组别 |
例数 |
阳性 |
阳性率(%) |
χ2检验 |
| 原发性肝病 |
48 |
28 |
58.33% |
|
| 慢性肝病 |
21 |
3 |
14.28% |
P＜0.01* |
| 正常人 |
20 |
0 |
0.00% |
|
*与原发性肝癌相比 2.原发性肝癌病理特征与PBMC AFP mRNA表达
伴远处转移的原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA全部为阳性(8/8)。未发现转移灶的原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA阳性率为50.00%(20/40)。TNM Ⅰ～Ⅱ期阳性率为40.91%(9/22)，Ⅲ～Ⅳ期阳性率73.08%(19/26)。两者差异有意义(P＜0.05)。
由表2可看出，多个肿瘤灶和肿瘤直径大于5 cm的PBMC AFP mRNA阳性率分别高于单个肿瘤灶和肿瘤直径小于5 cm者。但统计学显示差异无意义。
表2 肿瘤病理特征与PBMC AFP mRNA的关系
| 组 别 |
例数 |
阳性 |
阳性率(%) |
χ2检验 |
| 肿瘤灶 |
|
|
|
|
| 单个 |
20 |
9 |
45.00 |
|
| 多个 |
28 |
19 |
67.86 |
NS |
| 肿瘤直径 |
|
|
|
|
| ＜5 cm |
29 |
16 |
55.17 |
|
| ＞5 cm |
19 |
13 |
68.42 |
NS |
| 远处转移 |
|
|
|
|
| 无 |
40 |
20 |
50.00 |
|
| 有 |
8 |
8 |
100.00 |
P＜0.05 |
NS：no significance 3.原发性肝癌患者血清AFP水平与PBMC中AFP mRNA的表达
随着原发性肝癌患者血清AFP水平的增高，PBMC中AFP mRNA的检出阳性率也增高，但统计学显示差异无意义(见表3)。
表3 不同血清AFP水平与PBMC AFP mRNA阳性率
| 血清AFP (ng/ml) |
例数 |
阳性 |
阳性率
(%) |
χ2检验 |
| ＜100 |
27 |
14 |
51.85 |
|
| ≥100 |
21 |
14 |
66.67 |
NS |
| ＜400 |
37 |
20 |
54.05 |
|
| ≥400 |
11 |
8 |
72.72 |
NS |
NS：no significance
讨论
曾有人用白蛋白mRNA作为检测肝癌细胞存在于血液中的指标［8］。经研究发现，虽然白蛋白主要是由肝细胞分泌，但外周血白细胞也能表达白蛋白mRNA［4］。因此，白蛋白mRNA不能作为反映血液中肝癌细胞存在的指标。
AFP是由胎儿的卵黄囊和肝细胞合成及分泌，出生以后很快被抑制。当肝癌发生时，AFP基因被再次激活。在原发性肝癌患者PBMC中发现表达AFP mRNA的细胞，可以认为是肝癌细胞进入外周血所致［6，9］。
本实验结果显示原发性肝癌伴远处转移患者的PBMC AFP mRNA全部阳性，而未发现转移灶的原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA阳性率也达50.00%，提示即使临床上未见有转移灶，但外周血中已存在循环的癌细胞，继而易发生肿瘤转移。然而从肿瘤病理特征与PBMC AFP mRNA的关系来看，凡有多个肿瘤灶和肿瘤灶体积大的原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA阳性率高于单个肿瘤灶和肿瘤直径小的原发性肝癌患者的趋势，至于统计学显示差异无意义，可能是因病例较少之故。另外，结果还提示原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA阳性率与病程进展有关，TNM Ⅲ～Ⅳ期阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期。虽然早期病人的PBMC AFP mRNA阳性率比较低，但也说明在部分病人早期血液中就有癌细胞的存在。这一现象从一个角度表明肝癌复发和转移率高的一个重要原因是与肝癌细胞早期脱落于血液循环有关。
在慢性肝病有3例外周血AFP mRNA阳性，其中2例GPT＞100 U/ml，另1例GPT＞600 U/ml，AFP＞300 ng/ml。其PBMC AFP mRNA阳性的原因尚不清楚，文献报道亦有类似现象［2］。
在血清AFP阳性病例，随着血清AFP水平的上升，PBMC AFP mRNA阳性率有增高趋势。但统计结果显示血清AFP高水平和血清AFP低水平的PBMC AFP mRNA阳性率无差异。说明血清AFP仅代表肝细胞或肝癌细胞对AFP这种蛋白的分泌，并不代表肝癌细胞在血液中的存在。
本文研究结果充分表明，PBMC AFP mRNA可以作为肝癌血源性肿瘤播散的证据，并有可能成为判断肝癌血行转移的一项有用的预测指标。
作者简介：罗 伟，男，博士，副研究员。
参考文献
［1］Gomella LG,Raj GV,Moreno JG.Reverse transcriptase ploymerase chain reaction for prostate specific antigen in the management of prostate cancer〔J〕. J Urol,1997,158(2):326
［2］Lindemann F,Schlimok G,Dirschedl P, et al.Prognostic significance of micrometastatic tumor cells in bone marrow of colorectal cancer patients〔J〕.Lancet,1992,340:685
［3］Nakamori S,Kameyama M,Furukawa H, et al. Genetic detection of colorectal cancer cells in circulation and lymph nodes〔J〕.Dis Colon Rectum,1997,40:S29
［4］Matsumura M,Niwa Y,Kato N, et al. Detection of α-fetoprotein mRNA,an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma,in the circulation: a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,1994,20:1418
［5］Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate phenolchloroform extraction〔J〕.Anal Biochem,1987,162:1156
［6］Kanbara Y,Maekawa Y,Nakaya S, et al. Clinical significance of detection of AFP-mRNA in hepatocellular carcinoma〔J〕. Acta Hepatol Jpn,1996,37:731
［7］Iijima SN,Hamada H,Rdeey P, et al. Molecular structure of the human cytoplasmic β-actin gene:Interspecies homology of sequences in the introns〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:6133
［8］Carr BI,Kar S,An assay for hepatoma micrometastasis:albumin gene expression in peripheral blood from patients with advanced hepatocellular carcinoma (HCC) ［Abstract］〔J〕.Hepatology,1991,14:108A
［9］Louha M,Poussin K,Ganne N, et al. Spontaneous and introgenic spreading of liver-derived cells into peripheral blood of patients with primary liver cancer〔J〕.Hepatology,1997,26:998
(收稿日期：1998-12-07)
用户登录 
新用户注册