人肝癌组织中E-cadherin基因DNA单链构象多态性分析

肿瘤 1999年第5期第19卷 论著

作者：余焱林　严　俊　易正山　徐永华

单位：余焱林　严俊　徐永华　中国科学院上海细胞生物学研究所，上海200031；易正山　广州南方医院

关键词：肝肿瘤；基因，E-cadherin；DNA突变分析

　　摘要：目的　检测肝癌中E-cadherin的突变情况，探讨E-cadherin与肝癌发生和发展的关系。方法　采用PCR-SSCP方法，分析了12例肝癌旁组织、5例肝癌栓组织和22例肝癌组织DNA样品中E-cadherin基因第6、9和10外显子DNA单链构象多态性。结果　12例肝癌旁组织和4例分化较好的肝癌组织中，E-cadherin基因第6、9和10外显子均未见有异常。在18例恶性程度较高的肝癌组织中发现4例突变，其中2例突变发生在第9外显子，2例突变发生在第6外显子。5例肝癌栓组织中检出2例突变(占40%)，其中1例突变在第9外显子，另1例突变发生在第10外显子。结论　E-cadherin基因随肝癌的恶化，特别随转移潜能的获得，而发生突变频率的增加，表明它可能与肝癌的发展和转移相关。

SSCP ANALYSIS OF E-CADHERIN GENE IN HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMAS

YU Yan-lin，YAN Jun,YI Zheng-shan,XU Yong-hua.

(¹Laboratory of Molecular and Cellular Oncology,Shanghai Institute of Cell Biology,Shanghai　200031,China；²Nanfang Hospital,Guangzhou　510515,China)

　　Abstract：Objective　The purpose of this paper was to investigate the aberration of the E-cadherin in human hepatocellular carcinomas, and to provide evidence for a better understanding of the development of human hepatocellular carcinoma(HCC).Methods　Using the single strand conformation polymorphism analysis with polymerase chain reaction,aberration of the E-cadherin exon 6,9 and 10 were examined in 22 HCC (including 4 well differentiated and 18 poorly differentiated HCCs),12 adjacent tissues of HCC and 5 HCC emboli.Results　Structural abnormalities of E-cadherin gene were observed in 4 of 18 poorly differentiated HCCs,(2 with an abnormal exon 9,2 with an aberrant exon 6).Two of 5 HCC emboli carried the mutation,(one with an abnormal exon 9 and the other with a mutation of exon 10).However,in 12 adjacent tissues of HCCs and 4 well differentiated HCCs,structural abnormalities of E-cadherin exon 6,9 and 10 were not found.Conclusions　The results suggest the involvement of E-cadherin gene in development and metastasis of HCC.

　　Key words：　Liver neoplasms；Gene,E-cadherin；DNA mutational analysis

　　肝癌是我国及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一。肝癌的病理学研究表明，肝癌的发生和发展是一个多步骤、多基因参与的过程。其遗传学分析发现，在肝癌中染色体16q22-23区域杂合缺失的频率＞50%，而且相对特异^［1～3］，表明在染色体16的长臂区域可能存在有与肝癌发生和发展相关的肿瘤抑制基因。E-cadherin基因位于人染色体16q22.1区域；它是一种钙依赖的跨膜糖蛋白，主要介导上皮细胞之间的粘附，参与细胞分化，细胞粘附的建立和形态的发生，是组成细胞间连接复合物(junction complex)的关键分子^［4～6］。这种细胞间连接复合物是分化好的上皮细胞与细胞之间正常通信及维持正常细胞的形态所必需，若这种复合物被破坏，细胞就无序状态生长，形成肿瘤。因而E-cadherin被认为是一种抑癌基因的候选基因。许多研究表明不同癌细胞产生的E-cadherin的量和细胞侵染能力呈负相关；将E-cadherin基因cDNA导入具有侵染能力的肿瘤细胞中，表现出强烈的转移抑制活性，并能部分抑制肿瘤细胞转化的潜能，促进肿瘤细胞的分化，最近发现E-cadherin基因在食管癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中常发生突变^［7～10］，从而认为E-cadherin在这些肿瘤中起着对肿瘤生长和转移的抑制作用。Berx等^［8］的研究揭示虽然E-cadherin突变主要存在于16个外显子中的9个，但是外显子6～10的突变率相对较高。7例浸润性小叶乳腺癌中4例发生突变，突变位点分别位于外显子6、9、10。Hiraguri^［11］检测的10株乳腺癌细胞系中发现3株突变，其中外显子6、9的突变各占1株。在胃癌和胃癌细胞系中也发现了外显子6、9、10的突变频率相对高于其它外显子。Shimoyama等^［12］发现肝癌组织中，E-cadherin的表达量明显低于正常肝组织，认为E-cadherin表达量的减少是肝癌细胞高度去分化的特征之一，可能与肝癌的发生和发展及转移有关。但在肝癌组织中E-cadherin是否发生突变，未见报道。作者采用PCR-SSCP方法分析了39例肝癌组织和癌栓组织以及癌旁组织中E-cadherin基因外显子6、9、10的DNA单链构象多态性。

　　材料和方法

　　1.人正常肝组织和肝癌组织以及肝癌旁和肝癌栓组织材料均来源于广州南方医院。

　　2.引物为我室人工合成(见表1)。

表1　引物序列

　　3.基因组DNA抽提

　　从液氮中取出组织块约100 mg，经研磨成粉末状，移入匀浆器，加2 ml组织裂解液(4 mol/L异硫氰酸胍，匀浆后移入离心管中，用4 mol/L LiCl溶液沉淀细胞膜等碎片。含染色体DNA的上清，经酚、氯仿、异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤。石蜡标本，经脱蜡后抽提DNA。

　　4.外显子6、9、10体外扩增

　　50 μl PCR反应体系：DNA 0.3 μg，引物各25 pmol，dNTP 100 μmol/L，10×PCR缓冲液5 μl，MgCl₂ 2 mmol/L(外显子9和10)或2.5 mmol/L(外显子6)，加ddH₂O至50 μl，(采用放射性自显影进行SSCP分析，则加入2 μCi的α-³²P-dATP)。95 ℃变性5 min，加入Taq DNA聚合酶1U、液体石蜡适量，按94℃ 90 s，57℃(外显子6)/55℃(外显子9)/60 ℃(外显子10)100 s；72 ℃ 105 s，进行35个循环，最后72 ℃维持10 min。

　　5.SSCP分析

　　取15 μl PCR产物，加入15 μl上样缓冲液(99.9%甲酰胺、0.05%二甲苯青、0.05%溴酚蓝)混匀，98℃水浴5 min，冰上骤冷，立即上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上，置于4℃冰柜中电泳16 h，电泳完毕进行银染或放射自显影。

　　6.银染

　　取下聚丙烯酰胺凝胶，10%乙醇固定10 min，1.13%硝酸溶液氧化3～5 min，0.012 mol/L硝酸银溶液染色20 min，0.28 mol/L NaHCO₃、0.019%甲醛还原，待带型清晰后用10%乙酸终止，以上每种溶液处理后均要用ddH₂O冲洗。

　　结果

　　采用PCR-SSCP技术对22例肝癌(其中分化较好的肝癌组织4例，分化较差的肝癌18例)，12例肝癌旁组织、5例肝癌栓组织的DNA样品中E-cadherin基因第6、9、10外显子进行了分析，在12例肝癌旁组织和被检测的4例分化较好的肝癌组织中，E-cadherin基因第6、9、10外显子均未见有突变；但在18例恶性程度较高的肝癌组织中发现4例突变，占22.2%，2例突变发生在第9外显子，从SSCP带型来看，突变的带均要小，很可能是一种缺失突变，2例突变发生第6外显子；在5例肝癌栓组织中检出2例突变，占40%，其中1例突变部位在第9外显子，在SSCP电泳中可见到一条小的带；另1例突变发生在第10外显子(见表2，附图)。

表2　E-cadherin基因的突变与肝癌组织的病理分析

附图　E-cadherin基因外显子6、9和10的PCR-SSCP分析。a、b为银染，c、d为同位素掺入的放射自显影。N为肝癌旁组织，T为肝癌组织，C为肝癌栓组织。

　　讨论

　　正常组织的细胞与细胞彼此粘连又与细胞外基质相粘连，细胞与细胞的粘连分子有助于把细胞保持在适当的位置，维持细胞之间形态上和功能上的相互依存关系，一旦两相邻细胞生长发生接触，便呈接触抑制，导致细胞运动停止和生长抑制。人们已认识到细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用为细胞的生长、分化、衰老及死亡提供必需的信息，这些信息控制细胞形态的发生、细胞的衰老、死亡、组织分化、组织特定功能的获得和组织修复等^［13］。细胞粘附能力的下降使得细胞转变成无序状态，往往是细胞恶性转化的开始。

　　正常肝小叶中的肝细胞在静脉血管周围呈辐射状排列，而且紧密接触。在这种情况下，肝细胞不增殖，而处于静息状态。这种静息状态是维持肝组织特定功能所必需。Nakamura等^［14］曾利用原代培养成年大鼠肝细胞进行实验，说明了肝细胞的生长和分化功能是通过细胞与细胞间接触来调控的。在高密度下培养的肝细胞和正常的肝小叶中肝细胞一样，形成紧密的细胞与细胞间接触，其细胞生长停留在静息状态，此时即使加大量的生长因子，它们也不会增殖，却都完全具有肝细胞特有的功能。但一旦肝细胞的这种紧密接触遭到破坏，如肝损伤和实验性肝切除等，肝细胞就对生长因子作出反应，受到生长因子的调节，而恢复增殖能力。此时肝细胞受到正调节因子如生长因子EGF、HGF等调 ，促进肝细胞分裂增殖^［15］，同时还受到负调节因子如TGFβ、p53、Rb等调节，防止肝细胞生长失控。一旦损伤修复后，肝细胞外基质形成。肝细胞排列整齐，紧密接触，肝细胞恢复到正常静息状态，发挥正常的特定功能。如果肝细胞与细胞的正常连接不能形成，或粘附分子基因的缺失和表达的下降，都可能影响肝细胞之间正常的排列和紧密接触状态，造成细胞生长失控，最终导致肿瘤的发生。

　　E-cadherin基因位于人类染色体16q22.1区域，它编码一种钙依赖的跨膜糖蛋白，在上皮细胞中E-cadherin是形成正常连接复合物的关键分子。它的膜内结构域可以与α-catenin及β-catenin相互作用，并与细胞骨架相连，将各种胞外信息传递到细胞内，从而调节细胞的形态发生、分化和生长。近来许多研究表明E-cadherin的突变和表达量的变化与肿瘤的发生和转移密切相关。在转移性胃癌中，约50%的病例存在E-cadherin的突变。若将E-cadherin导入具有高转移潜能的肿瘤细胞后，能强烈抑制其转移活性，而且表达E-cadherin的细胞生长速率减慢并趋于分化。目前已发现E-cadherin基因在食管癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中常发生突变^［7～10］。Shimbyama等^［12］发现肝癌组织中，E-cadherin基因的表达量明显低于正常肝组织，认为E-cadherin基因表达量的减少是肝癌高度去分化的特征之一，可能与肝癌的发生和发展及转化有关。

　　本文采用PCR-SSCP的方法分析了39例肝癌组织、肝癌栓组织及肝癌旁组织中E-cadherin基因外显子6、9和10的DNA单链构象多态性。结果显示，在被检的12例肝癌组织和4例分化较好的肝癌组织中，E-cadherin基因第6、9和10外显子均未见有突变；在18例恶性程度高的肝癌组织中发现4例突变，占22.2%，而在5例癌栓组织中则出现2例突变。这表明E-cadherin参与癌的演进，并随肝癌的程度的恶化而突变频率增加，且还表现在具高转移潜能的组织中。

　　作者简介：余焱森，男，在读博士生。

　　参考文献

　　［1］Sakai K,Nagahara H,Abe K, et al.Loss of heterozygosity on chromosome 16 in hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol Hepatol,1992,7(3):288

　　［2］Konishi M,Rei Kikuchi-Yanoshita R，Tanaka K, et al.Genetic changes and histopathological grades in human hepatocellular carcinomas.Jpn J Cancer Res,1993,84(8):893

　　［3］Tsuda H,Zhang W,Shimosato Y, et al. Allele loss on chromosome 16 associated with progression of human hepatocellular carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:6791

　　［4］Gumbiner B,Stevenson B,Grmaldi A.The role of the cell adhesion molecule uvomorulin in the formation and maintenance of the epithelial junctional complex.J Cell Biol,1988,107:1575

　　［5］Kemler R.From cadherins to catenins:Cytoplasmic protein interactions and regulation of cell adhesion.Trends Genet,1993,9:317

　　［6］Shapirol L,Fannon AM,Kwong PD, et al. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature,1995,374:327

　　［7］Navarro P,Gomer M, Pizarro A,et al. A role for the E-cadherin cell-cell adhesion molecule during tumor progression of mouse epidermal carcinogenesis. J Cell Biol,1991,115:517

　　［8］Berx G,Cleton-Jansen AM,Nollet F, et al. E-cadherin is a tumour/invasion suppressor gene mutated in human lobular breast cancer.EMBO J,1995,14(24):6107

　　［9］Beckerk F,Atkinson MJ,Reich U,Becker I, et al. E-cadherin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas.Cancer Res,1994,54:3845

　　［10］Risinger JI,Berchuck A,Kohler MF, et al.Mutations of the E-cadherin gene in human gynecologic cancers.Nature Genet,1994,7:98

　　［11］Hiraguri S,Godfrey T, Nakamura H, et al.Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast cancer cell lines.Cancer Res,1998,58:1972

　　［12］Shimoyama Y,Hirchashi S.Cadherin intercellular adhesion molecule in hepatocellular carcinomas:loss of E-cadherin expression in an undifferentiatd carcinoma.Cancer Lett,1991,57(2):131

　　［13］Werb Z.ECM and cell surface proteolysis: regulation cellular ecology.Cell,1997,91:439

　　［14］Nakamura T,Nakayama Y,Ichihara A, et al.Reciprocal modulation of growth and liver functions of mature rat hepatocytes in primary culture by an extract of hepatic plasma membranes. J Biol Chem,1984,259:8056

　　［15］Asami O,Ihara I,Shimidzu N, et al. Purification and characterization of hepatocyte growth factor from injured liver of carbon tetrachloride-treated rats. J Biochem,1991,109:8

(收稿日期：1998-05-20　修回日期：1998-10-09)