p21^WAF1/CIP1过表达对人肝癌细胞恶性表型和细胞凋亡的影响

中华肿瘤杂志 1999年第2期第0卷 基础研究

作者：杨帆　王文亮

单位：710032 西安，第四军医大学病理学教研室

　　关键词： 肝肿瘤；癌，肝细胞；基因转染；细胞凋亡

　　【摘要】　目的　探讨p21^WAF1/CIP1过表达对人肝癌细胞恶性表型和细胞凋亡的影响。方法　用带有p21的真核表达载体PCEP，经基因转染，使其在有p53突变的人肝细胞癌细胞系(HCC-9204)中表达；通过流式细胞仪、透射电镜和DNA电泳确定凋亡细胞。结果　转基因后G₁期细胞增加，并且在G₁期前出现一凋亡峰，凋亡细胞占被检细胞总数的22.5%；电镜下可见部分细胞体积缩小，胞膜完整，有出芽现象，细胞器结构完整，致密的染色质边集于核膜内侧，呈明显的凋亡细胞的形态；琼脂糖凝胶电泳出现DNA梯形条带。转染p21后，细胞的恶性表型发生了逆转，表现为细胞在软琼脂中克隆形成能力降低，BrdU掺入量A值由对照组的1.38±0.11明显下降为0.77±0.06(P＜0.05)。结论PCEP-p21^WAF1/CIP1能够抑制肝癌细胞的生长及诱导细胞凋亡，因此该基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。

　　Effects of overexpression of p21^WAF1/CIP1 on the malignant phenotype and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells　　YANG Fan, WANG Wenliang. Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi′an 710032

　　【Abstract】　Objective　To study the effects of overexpression of p21^WAF1/CIP1 on the malignant phenotype and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells.Methods　p21^WAF1/CIP1 gene was transfected into a human hepatocellular carcinoma cell line, HCC-9204 with p53 mutation. Flow cytometry (FLC), transmission electron microscopy (EM) and DNA electrophoresis were used to identify apoptosis.Results　The transfected HCC-9204 showed increase in cell number in G₁ phase of cell cycle. Apoptosis was confirmed by the appearance of apoptotic peak on FLC, characteristic ultrastructural changes on EM and DNA laddering on electrophoresis. Apoptotic cells accounted for 22.5% of the total p21 transfected cells. An alteration of the malignant phenotype of cells was evidenced by the loss of anchorage-independent growth in soft agar and reduction BrdU incorporation.ConclusionThe results indicate that the p21^WAF1/CIP1 can inhibit proliferation and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells with p53 mutation.

　　【Subject words】　Liver neoplasms　　Carcinoma, hepatocellular　　Gene trasfection　　Apoptosis　p21^WAF1/CIP1

　　p21^WAF1/CIP1基因的表达产物属于与周期素-周期素依赖激酶作用的一类调节蛋白，它几乎可以和所有的周期素-周期素依赖激酶结合成复合物，从而抑制周期素依赖激酶的活性^［1］，并且还可以和增殖细胞核抗原(PCNA)结合形成复合物，抑制DNA的复制^［2］。野生型p53可以在转录水平上调p21^WAF1/CIP1，而突变型p53无此作用。野生型p53诱导p21蛋白表达可以引起多种肿瘤细胞的生长抑制^［3］，对DNA损伤因子的反应除可引起G₁期生长停滞外，还可以引起细胞凋亡^［4］。而p21^WAF1/CIP1在依赖p53或不依赖p53途径的细胞凋亡中的作用，至今仍无定论。为此，我们将外源性p21^WAF1/CIP1通过逆转录病毒载体转染到人肝细胞肝癌细胞系(HCC-9204)，使得p21^WAF1/CIP1过表达，以观察其对肝癌细胞恶性表型和细胞凋亡的作用。

　　材料与方法

　　1.材料：WAF1全长cDNA 2.1 kb连接于PCEP逆转录病毒表达载体NotⅠ位点上(由Bert Volgelstein博士惠赠)，NotⅠ酶(Promega)，1640培养基、Lipofectin(Gibco)，小牛血清(华美公司)，Hygromycin(Sigma)，p21单抗，鼠抗Brd U(中山公司)。Brd U标记试剂(迈新公司)。

　　2.p21^WAF1/CIP1基因转染：采用脂质体转染方法进行基因转染。细胞分为PCEP-p21^WAF1/CIP1、PCEP空载体和阴性对照3组，在含潮霉素0.25 mg/ml的培养基中筛选14天。

　　3.外源p21^WAF1/CIP1表达的检测：用免疫荧光方法对细胞p21^WAF1/CIP1进行标记，流式细胞仪分析荧光强度，以无关抗体阴性设对照组。

　　4.软琼脂集落形成实验：将1×10⁴个PCEP-p21^WAF1/CIP1细胞或PCEP细胞接种于含0.6%琼脂糖底层培养基/0.3%琼脂糖顶层培养基中，14天后观察集落形成情况。

　　5.5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(Brd U)掺入实验：将1×10⁴细胞/孔接种于96孔板，细胞贴壁后加入用培养液1∶100稀释的Brd U标记试剂，再培育3小时，用95%的酒精固定20分钟，按常规ELISA方法以鼠抗Brd U检测Brd U掺入情况。

　　6.细胞周期和细胞凋亡分析：收集细胞，70%冷乙醇固定，碘丙啶(PI)染色，采用流式细胞仪检测细胞各期的分布及凋亡情况。同时提取细胞DNA，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压2 V/cm，4小时，溴乙啶(0.5 μg/ml)染色，紫外灯下观察。

　　7.透射电镜标本的制备：细胞离心后的沉淀用3%戊二醛固定，1%锇酸后固定，脱水包埋，切片，在透射电镜下观察。

　　结　果

　　1.p21^WAF1/CIP1基因的转染：PCEP载体带有一潮霉素抗性筛选基因，因此转入p21^WAF1/CIP1与PCEP空载体的细胞能够在含潮霉素的培养基中生存，而阴性对照组细胞则在4，5天内全部死亡。筛选14天后，细胞克隆长出，初步说明细胞转染获得成功。

　　2.p21^WAF1/CIP1蛋白表达水平：流式细胞仪检测外源性p21^WAF1/CIP1基因转染后，细胞p21^WAF1/CIP1单克隆抗体免疫荧光染色值明显升高，PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204细胞FITC染色率为90.4%，而PCEP/HCC-9204细胞FITC染色率为1.7%。经χ²检验，二者差异有显著性(P＜0.001)。

　　3.转染p21^WAF1/CIP1对HCC-9204细胞恶性表型的影响：p21^WAF1/CIP1基因稳定表达早期，在没有任何外加因素的情况下，细胞生长缓慢，并有较多脱离瓶壁的漂浮死细胞，而在同样培养条件下，对照组细胞生长状态良好。PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC- 9204细胞未能在软琼脂中形成集落，而PCEP/HCC-9204细胞和HCC-9204细胞均可见桑椹样细胞集落(图1)。PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204 Brd U掺入量A值(吸光度，曾称光密度OD)为0.77±0.06，而对照组A值分别为1.38±0.11和1.27±0.10。经统计学处理，PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204细胞Brd U的掺入量显著低于未转染p21^WAF1/CIP1基因的细胞(P＜0.05，图2)。

　　4.转染p21^WAF1/CIP1对HCC-9204细胞周期和细胞凋亡的影响：收集转染p21^WAF1/CIP1基因稳定表达后第四代细胞进行流式细胞仪检测，结果显示出现一个凋亡峰，凋亡细胞占细胞总数的22.5%(图3)。细胞周期分布结果见表1。

图3　PCEP-p21WAF1/CIP1/HCC-9204细胞 　　细胞周期和细胞凋亡分析 表1　细胞周期分布(%)

　　5.透射电镜观察：可见部分PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204细胞体积缩小，电子密度反差低，呈“暗细胞”状态。内质网、线粒体等细胞器结构完整，核膜完整，有出芽现象，质地致密的染色质碎片边集于核膜内侧，并可见凋亡小体(图4)。DNA琼脂糖凝胶电泳显示PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204细胞DNA呈现梯状条带(图5)。

图4　HCC-9204细胞，转染p21WAF1/CIP1透射电镜观察，细胞皱缩，染色质断裂边集在核膜内侧，胞膜核膜完整，内质网无肿胀。×7500

1：HCC-9204细胞DNA；2：Marker(λDNA EcoR I+Hind III)；3：PCEP-p21WAF1/CIP1/HCC-9204漂浮细胞DNA呈梯状条带 　　图5　DNA片段分析，1.5%琼脂糖凝胶电泳

　　讨　论

　　我们在HCC-9204中利用逆转录病毒载体系统，成功地转染了外源性p21^WAF1/CIP1，并能过量稳定表达。研究结果证实，过量表达的外源性p21^WAF1/CIP1抑制了Brd U掺入率。胸腺嘧啶为DNA合成的前体物质，在DNA复制过程中，胸腺嘧啶的同源物Brd U就可掺入到复制后的DNA中^［5］，这可以用抗Brd U的抗体通过酶联免疫法定量计算出Brd U的掺入率。因为只有增殖的细胞DNA中才有Brd U掺入，所以Brd U掺入率的降低说明p21^WAF1/CIP1过表达抑制细胞由G₁期进入S期。流式细胞仪检测细胞周期的结果显示，PCEP-p21^WAF1/CIP1/HCC-9204细胞G₁期细胞数量显著增加，而S期细胞数量降低，其原因可能是p21^WAF1/CIP1过表达的蛋白通过与细胞周期依赖激酶(CDK)及PCNA的相互作用使得细胞的生长受到抑制。转染p21^WAF1/CIP1细胞在软琼脂中无集落形成，说明不依赖贴壁生长这一肿瘤细胞恶性表型已发生了逆转。

　　细胞转染p21^WAF1/CIP1后，许多克隆逐渐死亡，培养过程中见漂浮细胞多，收集这些细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可见明显梯形条带，断裂带相距约180～200 bp。这是由于p21^WAF1/CIP1过表达后启动了凋亡程序，活化了核酸内切酶，使之作用于DNA，产生典型的DNA片段。凋亡细胞具有以下特点：(1)由于核酸内切酶激活，导致DNA降解，凋亡细胞的DNA含量减少，与DNA结合的特异性染色因而也随之减少。(2)细胞膜结构完整，通过流式细胞仪不仅可区分细胞周期，而且可以判断凋亡细胞的数量^［6］。本研究流式细胞仪检测发现，在G₁期前有一亚二倍体的细胞群，与细胞碎片明显不同，经流式细胞仪凋亡软件处理确定为凋亡峰。电镜结果进一步证实了过表达p21^WAF1/CIP1可引起HCC-9204细胞发生自发凋亡。p21^WAF1/CIP1诱导细胞凋亡的途径目前尚不清楚，需要进一步研究。

　　本课题受自然科学基金资助(No.39470771)

　　参考文献

　　1　Harper JW, Adami GR, Wei N, et al. The p21 CDK-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G₁ cyclin-dependent kinases. Cell, 1993, 75:805-816.

　　2　Waga S, Hannon GJ, Beach D, et al. The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature, 1994, 369:574-578.

　　3　E1-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 1993, 75:817-825.

　　4　Liebermann DA, Hoffman B, Steinman RA. Molecular controls of growth arrest and apoptosis: p53-dependent and independent pathways. Oncogene, 1995, 11:199.

　　5　Trauth BC, Keesey J. Guide to cell proliferation and apoptosis methods. Germany: Boehringer Mannhaim, 1996: 10-14.

　　6　Telford WG, King LE, Fraker PJ. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogenneous cell population using flow cytometry. J Immunol Methods, 1994, 172:1-16.

(收稿：1998-03-09　　修回：1998-06-11)