具有高转移潜能的人肝癌细胞系的建立及其生物学特性

中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 基础研究

作者：田健　汤钊猷　 叶胜龙　刘银坤　林芷英

单位：200032 上海医科大学中山医院肝癌研究所

　　关键词： 肝肿瘤；癌，肝细胞；肿瘤细胞，培养的；肿瘤转移；甲胎蛋白；染色体

　　 　　【摘要】　目的　利用裸鼠人肝癌高转移模型(LCI-D20)的皮下移植瘤组织在体外建立一株具有高转移潜能的人肝癌细胞系(MHCC97)，并对其一般生物学特性进行观察。方法　将分离的瘤细胞制成细胞悬液，用10%人AB型血清的高糖DMEM培养液建成该细胞系，采用流式细胞术和染色体G-显带方法，进行细胞遗传学分析；用ABC免疫组化法，观察其肺转移灶中癌细胞甲胎蛋白(AFP)表达情况。结果　MHCC97细胞为典型的上皮样细胞，符合一般上皮性恶性肿瘤细胞的病理学特征。该细胞经皮下和肝内接种均可使裸鼠致瘤，并发生肺部转移。肝内接种者，肺转移达100%(12/12)。MHCC97细胞为异倍体细胞，染色体均为超二倍体，i(1)(q)和 der(4)(pter→q35::?)等为其标志染色体，未显示有完整Y染色体存在。肺转移灶的癌细胞AFP阳性。结论　MHCC97细胞具有与原移植瘤相似的生物学特性。染色体的畸变可能与其发生发展有关。

　　 Establishment of a human hepatocellular carcinoma(HCC) cell line with high metastatic potential (MHCC97) and its biological characteristics　　Tian jian, Tang Zhaoyou, Ye Shenglong, et al. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】　Objective　To establish and characterize a human hepatocellular carcinoma cell line with high metastatic potential derived from a subcutaneous xenograft of metastatic human HCC in nude mice (LCI-D20).Methods Single-cell suspension collected by tearing tumor tissues with forceps was transferred to the tissue culture flasks for culture in vitro in medium DMEM supplemented with 10% human group AB serum. Cytogenetic studies were performed on this cell line using flow cytometry and chromosome G-banding. AFP of theprimary xenografts and lung metastatic lesions was detected by using ABC immunohistochemistry. The rates of its tumorigenicity and metastasis in nude mice were evaluated. Results　The MHCC97 cells showed typical epithelial appearance. Upon subcutaneous or intrahepatic inoculation in nude mice, the xenograft grew and metastasized to the lungs. The metastatic rate was 100%. The cancer cells of lung metastatic foci were AFP positive. Aberrant chromosomes i(1)(q) and der(4)(pter→q35::?) were its chromosome markers.Conclusion　The MHCC97 cell line maintained the biologic characteristics as its original xenografts. The presence of the reported chromosomal aberrations may be related to carcinogenesis and progression of HCC.

　　【Subject words】　Liver neoplasms　　Carcinoma,hepotocellular　　Tumor cells, cultured　　Neoplasm metastasis　　Alpha-fetoproteins　　Chromosome

　　原发性肝癌已成为我国最常见的恶性肿瘤之一，其侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因。目前国内外对肝癌转移机制研究主要局限于手术切除标本和一些低转移肝癌细胞株(系)的某些生物学特性的观察，而它们均不能重现肝癌转移的整个临床过程。因此，人肝癌转移动物模型和细胞株(系)的建立势在必行。目前，人肝癌转移动物模型已为我所成功建立^［1］。我们利用人肝癌转移模型的皮下移植瘤经体外传代培养，获得一人肝癌高转移细胞系，命名为MHCC97，它保留了原移植瘤合成甲胎蛋白(AFP)和转移最基本的生物学特性。

材料与方法

　　1.瘤源背景：裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D₂₀)的瘤源，取自一39岁男性肝细胞肝癌患者的肝右叶转移灶的手术切除标本，随即原位接种于裸鼠肝。经多次筛选，获得一高转移的人肝癌裸鼠模型，接种20天后，肺转移率为100％。该患者血清HBsAg阳性，AFP高水平表达^［1］。本实验瘤细胞取自该模型肝内移植瘤的裸鼠皮下再接种后所形成的皮下移植瘤。

　　2.试剂：DMEM细胞培养液为Gibco公司产品。人AB血清由上海市中心血库提供。胰蛋白酶(1∶250 Difco)、培养瓶、培养皿系Costar 公司产品。

　　3.细胞培养： 荷瘤裸鼠断颈处死，取出皮下移植瘤，剔除坏死瘤组织和纤维组织。用D-Hanks液(pH 7.2)洗2次，再用无血清DMEM培养液洗1次。在含10％人AB型的DMEM培养液中用眼科镊将其撕碎，遂将含有瘤细胞的该培养液吸入离心管内，静置10分钟，吸出含有瘤细胞的上层液于另一离心管内，1 000r/min离心5分钟，弃上清，沉淀细胞用蒸馏水低渗处理10秒，致红细胞膜破裂溶解(若血细胞数量不多，该步可免去)，速补足培养液，同前离心。沉淀细胞用含10％人AB型血清DMEM培养液培养。次日吸去漂浮未贴壁的死细胞和杂细胞的培养液，加足新培养液，视培养液颜色更换培养液。用0.02%EDTA去除纤维细胞^［2］。

　　4.超微结构观察： 将贴壁生长的细胞刮下，PBS洗涤，离心，2.5%戊二醛室温固定，再用2%四氧化锇后固定。Epon树脂包埋， 超薄切片，醋酸铀染色，JEM1200电镜观察。

　　5.流式细胞术分析：细胞DNA倍体分析方法参照文献［3］。以正常人外周血淋巴细胞作为对照。

　　6.染色体制备：参照Seabright等^［4］的方法, 稍作改进。(1)常规染色体：细胞经秋水仙素(colcemid,终浓度0.25μg/ml )处理10～15小时后，用胰蛋白酶消化，1 200 r/min 12分钟，吸去上清液，0.075 mol/L KCl低渗处理20分钟，加入固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）混匀预固定，同前离心，吸去上液,再重复固定2次，最后用适量固定液制成细胞悬液,制片,Giemsa染色,拍照分析。(2)G显带技术：将上述未染色的玻片，60℃烘烤8～10小时, 0.25％胰蛋白酶消化3.5分钟, Giemsa染色，拍照，分析。

　　7.免疫组织化学染色：常规ABC免疫组化法，一抗为兔抗人AFP多克隆抗体（效价1:300, Dako公司产品）。

　　8.成瘤性与转移性：将生长旺盛的不同代细胞制成0.2 ml细胞悬液（含10⁶～10⁷个细胞），接种于15只3～4周龄裸鼠背侧或腋下皮下，观察致瘤性。瘤结节形成后处死动物，取出瘤组织和肺组织。10％甲醛固定，用于HE和免疫组化染色。同时再将部分皮下瘤组织原位接种于12只裸鼠肝内，30天后处死动物，同前处理。

结果

　　1.形态学观察：MHCC97细胞的皮下接种瘤与原移植瘤结构基本相同（图1）。癌细胞呈巢状分布、间质少，细胞为多边形，核浆比例大，核异形性，核膜凹陷，核仁清楚，核分裂相多见，并可见一些多核的瘤巨细胞；贴壁生长的细胞具有典型的上皮样细胞形态，细胞排列紧密，细胞界限清楚、核仁明显。超微结构显示，细胞核形状极不规则，核膜深凹，常染色质增多，核仁大，边移，核分裂相多，胞质内可见较多的溶酶体和髓样小体, 线粒体肿胀，细胞表面微绒毛多而长（图2）。

图１ 裸鼠皮下移植瘤组织学结构HE染色．la：原移植瘤；MHCC97细胞系的皮下瘤图2 MHCC97细胞超微结构．2a：细胞表面多而长的微绒毛，胞质中肿胀线粒体；2b：细胞核膜深陷，肿胀线粒体和髓样小体

　　2.DNA含量：细胞均为异倍体细胞，DNA含量指数为正常人外周血淋巴细胞的1.5倍。

　　3.染色体检查：挑选分散良好的100个中期分裂细胞进行染色体分析。结果显示，该细胞染色体核型变异大，均出现数目和结构的畸变(图3)，染色体数分布范围在59～65条。它们分别占59＝1/60=37/61=36/62=17/63 =5/64=3 / 65=1。染色体众数为60条和61条，占总数的73％。G-显带分析,其核型组成为59～65,X；-Y,+2,+3,-4,+5,+6,+7×2,+11,+12×2,-13,-14,-15,+16,+18,+20,-21,der(x;?) (xqter→p11.1::? →xq11→xqter),i(1)(q),der(4) (pter→q35::?),t(7;9)(7qter→q11.1::9p11→qter), i(8)(q), t(9;14) (9qter→q11::14p11→qter), t(13;17) (13qter→q14::17q23→qter) , der(22) (qter→p13::?)。

图3　G-显带分析分裂中期细胞的染色体核型

　　4.免疫组化结果：移植瘤和肺转移灶AFP显示阳性。

　　5.成瘤性与转移性：皮下接种的15只裸鼠20天左右均出现瘤结节，以后生长明显增快。该皮下瘤组织再原位接种和瘤细胞裸鼠肝内注射，均可发生癌细胞的肺部转移, 转移率100%。这些瘤细胞呈浸润性生长，常突破肝被膜侵犯腹腔和皮下，偶尔也累及膈肌。

讨论

　　在体外建立人癌细胞株是研究人类肿瘤的一个重要手段。肿瘤细胞的体外培养建株是一项难度较大的工程^［5］，这是因为体外模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异。在体外生存一定时间后，细胞往往会发生衰退死亡，即使能在体外生存，也常发生某些生物学特性的改变或丢失^［6］。

　　原发瘤组织直接用于体外建系的成功机率极低^［7］。利用原发瘤裸鼠转移模型的移植瘤组织作为体外培养建系的瘤源，可增强癌细胞的活力^［8］。在建系的过程中，我们不断摸索和调整培养条件和培养方法，同时保证培养环境的相对稳定。我们体会，高糖成分的DMEM培养基和人AB型血清较适宜本细胞的生长，而不利于纤维细胞的生长。高活力瘤组织和纤维细胞的有效剔除也是建株的重要因素。组织块培养法不宜作为MHCC97细胞系建立的有效方法，因它含有较多的纤维细胞，镊子的机械分离瘤细胞也是减少肝癌组织中纤维成分污染的一个途径。

　　根据MHCC97细胞系的细胞学和超微结构特征以及染色体分析证实，该细胞系符合一般人恶性肿瘤的病理学和遗传学特征。其成瘤性以及细胞AFP的阳性表达结果，均提示该细胞系为人肝癌细胞系，尤其是该细胞系的瘤源是直接取自裸鼠人肝癌高转移模型的皮下移植瘤组织。另外，该细胞的皮下和肝内移植瘤经病理诊断证实为人肝细胞肝癌。 MHCC97细胞系的转移行为证实了该细胞系为高转移人肝癌细胞系，肺为其优先转移的靶器官。

　　志谢　上海医科大学生物学教研室李修琪、殷民老师在染色体制作和分析上给予指导

参考文献

　　1　Sun FX,Tang ZY,Liu KD,et al. Establishment of a metastatic modal of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthtopic implantation of histologically intact tissue. Int J Cancer, 1996, 66:239-243.

　　2　Liao SK, Dent PB, McCulloch PB. Characterization of human malignant melanoma cell lines. J Natl Cancer Inst, 1975,54:1037-1044.

　　3　Liao SK, Perng YP, Lee LA, et al. Newly established MST-1 tumour cell line and tumour-infiltrating lymphocyte culture from a patient with soft tissue melanoma (clear cell sarcoma) and their potential applications to patient immunotherapy. Eur J Cancer,1996,32:346-356.

　　4　Seabright M. A Rapid banding technique for human chromosomes. Lancet, 1971,ii:971-972.

　　5　Sacks PG, Parnes SM, Gallick GE, et al. Establishment and characterization of two new squamous cell carcinoma cell lines derived from tumors of the head and neck. Cancer Res, 1988,48:2858-2866.

　　6　Okabe T, Sato N, Kondo Y,et al. Establishment and characterization of a human cancer cell line that produces humun colony-stimulating factor. Cancer Res, 1978,38:3910-3914.

　　7　Rheinwald JG , Beckett MA. Tumorigenic keratinocyte lines requiring anchorage and fibroblast support cultured from human squamous cell carcinomas. Cancer Res,1981,41:1657-1661.

　　8　Koura M, Isaka H. Establishment of a human colon adenocarcinoma cell line producing carcinoembryonic antigen. Gann 1980,71:313-318.

(收稿：1998-01-15　　修回：1998-04-30)