伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌血液AFPmRNA表达情况

中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 简　　报

作者：刘扬　钱光相　张柏和　陈汉　吴孟超　傅继梁　黄长辉

单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、钱光相、张柏和、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)，分子生物开放实验室(黄长辉)

　　肝癌细胞播散入血液循环，是造成术后肝内复发或肝外远处器官转移的主要原因之一。我们检测了伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌血液AFPmRNA表达情况，现将结果报告如下。

材料与方法

　　1995年11月～1996年10月收入长海医院康复部的伴有肝外远处器官转移的AFP(+)肝癌患者21例，其中男性20例，女性1例。年龄在45～62岁，平均年龄52.5岁。其血清AFP在(400～30 000) μg/L之间(肺脏转移者17例，骨骼转移者4例)。选择同期收入本院的不伴有肝外远处器官转移的AFP(+)原发性肝癌患者72例，其中男性65例，女性7例。年龄在42～67岁，平均年龄51.4。其血清AFP在(400～200 000) μg/L之间。以上患者均经B超，CT或MRI检查及血清AFP检测证实为原发性肝癌(部分患者术后经病理证实)。

　　分别抽取每例患者周围静脉血液5 ml，应用巢式RT-PCR检测血液中AFPmRNA。具体操作如下：(1)有核细胞的制备：采用红细胞溶解法。(2)抽提细胞总RNA：采用异硫氰酸胍一步抽提法。(3)合成cDNA：应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。(4)巢式PCR：PCR循环条件为：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。两轮PCR引物分别设计如下：外端同义链(EX-sense)：位于人AFPmRNA外显子1位置(核苷序列中第90～112碱基处)。外端反义链(EX-antisense)：位于人AFPmRNA外显子2位置(核苷序列中第263～241碱基处)。内端同义链(IN-sense)：位于外显子1和2之间(核苷序列中第122～145碱基处)。内端反义链(IN-antisense)：位于人AFPmRNA外显子3位置(核苷序列中第200～222个碱基处)。具体碱基序列EX-sense 5′-ACTG-AATCCACAACACTGCATAG-3′　EX-antisense 5′-TGCAGTCAATGCATCTTCACCA-3′　IN-sense 5′-TGGAATAGCTTCCATATTG-GATTC-3′　IN-antisense 5′-AAGTGGCTTC-TTGAACAAACTGG-3′。

　　根据设计要求，首轮PCR产物为174bp，两轮PCR终产物为101bp。

　　采用微机技术从Pc基因软包中寻求对两轮PCR产物仅有一个酶切位点的核酸内切酶PstI，其可将首轮PCR产物174bp酶切成102bp及72bp两个片段，也可将PCR终产物(101bp)酶切成60bp及41bp两个片段。

　　统计学分析：采用卡方检验。

　　结果　21例伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌患者血液AFPmRNA均表达阳性(100%)；72例不伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌患者中，有29例血液AFPmRNA表达阳性，占40.3%。

　　讨论　近年来，国外学者应用RT-PCR检测到血液或淋巴结组织中肿瘤细胞特异性mRNA的存在，以间接的方式推测肿瘤细胞发生转移。肝癌细胞溶解破坏所释放的AFPmRNA在血液中存在大量RNA酶的状况下，不可能存在或被立即破坏，因此从血液中检测到AFP mRNA，可以判断其来自于血液中播散的肝癌细胞。

　　本实验表明，21例伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌患者血液AFPmRNA均表达阳性，72例不伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌患者中仅有29例血液AFPmRNA表达阳性(P＜0.01)。说明伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌患者血液中均存在播散的肝癌细胞或微小转移灶(micrometastasis)，是肝癌术后复发或转移的重要原因之一。

　　本课题为军队重点实验室基金资助项目

(收稿：1997-11-18　　修回：1998-06-25)