耐阿霉素肝癌细胞HepG2表达Fas的变化

中国普外基础与临床杂志 2000年第4期第7卷 基础与实验研究

作者：项良光　林新龙　李伟青　陈中

单位：项良光 林新龙（福建省福清市医院外科　福清　350300）；李伟青 陈中（福建医科大学福清教学医院外科　福清　350300）

　　关键词： 阿霉素；Fas；肝癌细胞

　　【摘要】　目的　探讨化疗中Fas与肿瘤细胞耐药性的关系。方法　采用细胞生物学方法建立耐阿霉素的肝癌细胞HepG2株，并应用免疫组织化学方法观察该耐药细胞Fas表达水平的变化。结果　未经阿霉素诱导的不耐药的HepG2细胞仅弱表达Fas，并主要在细胞膜； 耐阿霉素的HepG2细胞表达Fas增强，并以胞浆为主。同时细胞的死亡率亦发生变化，耐药株在0.1 μg/ml 阿霉素中的死亡率与非耐药株在无ADM中死亡率比较差异无显著性意义(P＞0.05)，但与非耐药株在0.1 μg/ml ADM中的死亡率比较差异则有显著性意义(P＜0.05)。结论　Fas表达水平的变化可能是体内癌细胞耐药的机理之一。

　　【中图分类号】　R735.7； R979.1　　　【文献标识码】　A

　　【文章编号】　1007-9424(2000)04-0229-02

CHANGES OF EXPRESSION Fas OF THE ADRIAMYCIN-RESISTANCE HEPATIC CARCINOMA CELLS (HepG2 CELL LINES)

XIANG Liang-guang，LIN xin-long

　　（Department of General Surgery, Fuqing City Hospital, Fuqing 350300）

　　LI Wei-qing

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of the drug-resistance characteristic of neoplasm cell on the expression of Fas during the chemical medi-cure.Methods　The adriamycin-resistance hepatic carcinoma cells (HepG2 cell lines) were estabilished by cell biology. Changes of expression of the HepG2 cell lines was determined by immunohistochemistry. Results　When the HepG2 cell lines were not induced by adriamycin, the expression of Fas of them was weak and Fas mainly existed in cell membrane. When induced by adriamycin, the expression was enhanced and Fas mainly existed in cytochylema. Simultaneously, the death rate of the cell lines changed. The death rate of the drug-resistance cell lines in 0.1 μg/ml ADM was almost as same as that of non-drug-resistance cell lines without ADM (P＞0.05) and was significantly different from that of non-drug-resistance cell lines in 0.1 μg/ml ADM (P＜0.05). Conclusion　Changes of the expression of Fas may be one of the drug-resistance mechanisms of carcinoma cell.

　　【Key words】　Adriamycin　　Fas　　Hepatic carcinoma cell

　　近年来，细胞凋亡理论得到飞速发展，并逐渐应用于指导临床工作，如肿瘤的放疗、化疗等。而肿瘤的放疗和化疗都是通过促使癌细胞凋亡来实现的，但是肿瘤细胞的耐药性常是化疗失败的原因。目前Fas分子做为细胞凋亡信号传递的重要环节，在肿瘤化疗中的作用日益受到重视，但其与肿瘤细胞耐药性的关系研究尚少，为此我们开展了本项研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂

　　RPMI 1640培养液和小牛血清(Gibco公司)，MTT DMSO (Sigma公司)，抗Fas多克隆抗体(IV-18)和Cat#sc-714 (Santacug公司)，SP试剂盒(福州

　　Maxin公司产品)，HepG2细胞(武汉大学中国典型培养物冻存中心)。

　　1.2　耐阿霉素肝癌HepG2株的建立

　　取HepG2细胞置含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，而后依次接种于含不同浓度阿霉素的RPMI 1640培养液中，阿霉素浓度梯度为0、0.001、0.005、0.1 μg/ml，每种浓度培养14天。胰酶消化，2～3天传代1次。可稳定生长的HepG2细胞在含0.1 μg/ml阿霉素的RPMI 1640培养液中培养2个月后，其耐药性能持续1周左右。

　　1.3　实验方法

　　在6孔培养板中每孔放入1片经预处理的盖玻片，然后加入含2×10⁵个/ml悬液2 ml。置37℃含5%CO₂的培养箱中培养。另取不耐药HepG2细胞同法培养，作为对照组。48小时后取出盖玻片，标本半干燥，以4℃丙酮固定10分钟，0.8% Triron x-100 (PBS)液微波59℃ 2×5分钟，常规SP法染色。一抗Fas多克隆抗体稀释度为1∶100，DAB染色按试剂盒说明书进行。最后在TMAGER800彩色图像分析仪上进行图像分析。

　　另取耐药HepG2以2×10⁴个/孔接种于96孔培养板上(对照组为不耐药HepG2)，每孔100 μl，48小时后加入20 μl 5 mg/ml MTT^〔1〕(PBS)液继续培养4小时，弃上清液，再每孔 加入100 μl DMSO， 在37℃继续培养20分钟，而后置自动酶标仪波长570 nm处比色测定吸光度值，所得结果以细胞死亡率(%)表示。

　　1.4　统计学处理

　　所得结果以±s表示，采用t检验， P＜0.05为差异有显著性意义。

　　2　结果

　　未经阿霉素诱导的不耐药的HepG2细胞仅弱表达Fas，且主要在细胞膜上。在含0.1 μg/ml阿霉素的RPMI 1640培养液中培养2个月具备耐药性后，HepG2细胞表达Fas增强，并以胞浆为主。同时，耐药株与非耐药株细胞的死亡率亦发生变化，当ADM为0.1 μg/ml时，耐药株和非耐药株的细胞死亡率分别为7.16%±1.20%和21.39%±3.43%，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)； 当ADM为0 μg/ml时，耐药株与非耐药株的细胞死亡率分别为3.15%±1.13%和3.53%±0.72%，两者比较差异无显著性意义(P＞0.05)。

　　耐药株与非耐药株Fas表达上的变化： 耐药株为152.914±4.079个像素单位，非耐药株为139.254±3.416像素单位。经t检验，两者在Fas表达上差异有显著性意义(P＜0.05)。

　　3　讨论

　　肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其手术切除率及5年生存率都较低，大量病例有赖于各种综合性的治疗，其中化疗是很重要的手段，然而肿瘤细胞的耐药性常是化疗失败的原因。近年来的研究发现，各种耐药基因MDR的存在均与肿瘤细胞耐药性有关，但经其反义核苷酸中和后并不能完全消除其耐药性^〔2〕，提示可能还有其它的耐药机理存在。

　　本实验结果显示，未经阿霉素诱导的不耐药的HepG2细胞弱表达Fas，且主要在细胞膜上，经过诱导具备耐药性后，HepG2细胞表达Fas增强，并以胞浆为主。同时细胞的死亡率亦发生变化，耐药株在0 μg/ml ADM中与非耐药株死亡率比较差异无显著性意义(P＞0.05)； 耐药株在0.1 μg/ml ADM与非耐药株在0.1 μg/ml ADM中比较差异则有显著性意义(P＜0.05)。

　　速溶型阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，可抑制核酸合成，并可与DNA结合。Zhang^〔3〕在体外实验证实阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡。

　　细胞表面的Fas分子是一种凋亡信号受体，属于Ⅰ类膜蛋白^〔3，4〕。纯化的Fas分子量约为50 kd，属TNF受体(TNFR)家族，Fas的胞浆区有一大约为80个左右的氨基酸区为死亡功能区(D.D.)^〔4，5〕。Fas分子广泛表达于不同组织，尤其高表达于胸腺、心、肝、肾组织，提示Fas分子具有广泛的生物学意义。表达Fas的细胞在用Fas配体(FasL)^〔6〕或Fas抗体^〔7〕作用后，可在数小时内凋亡。近年发现Fas分子在胞浆亦可表达，其结果是抑制细胞的凋亡过程^〔8〕，其可能的机理是，胞浆中Fas分子增多时，可能通过竞争性抑制作用，使Fas配体或其天然抗体与膜Fas分子结合减少，从而抑制凋亡信号的传递。许多文献报道，肿瘤细胞表达Fas增强后对Fas Ab的敏感性增强^〔9，10〕。

　　我们推测，经阿霉素作用后HepG2细胞表达Fas水平的变化可能是细胞的一种自我保护。而在体外，在无Fas配体或天然抗体介入的条件下，单纯胞浆Fas表达的增强并不具备细胞保护的能力，但其表达水平的变化可能在癌细胞耐药的机理中有一定的意义。

　　【作者简介】　项良光(1970年-)，男，福建省福清人，医学学士， 主治医师，目前从事在体外条件下肝癌细胞凋亡的机理及其调控的研究。

参考文献

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　　2，曹广文， 杜　平. 现代癌症生物学治疗学 〔M〕. 北京： 人民军医出版社， 1995∶147～153

　　3，Zhang XD. An electron microscopic study of apoptosis induced by adriamycin in human hepatocellular carcinoma cells of Hcc-9204 line 〔J〕. Hepatol, 1995; 23(Suppl)∶231

　　4，Itoh N. A novel protein domain required for apoptosis: mutational analysis of human Fas antigen 〔J〕. Biol Chem, 1993; 268(5)∶10932

　　5，Tartaglia A, Ayres TM, Wong GH, et al. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death 〔J〕. Cell, 1993; 74(9)∶845

　　6，Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family 〔J〕. Cell, 1993; 75(12)∶1169

　　7，Wong GHW. Fas antigen and p55 TNF receptor signal apoptosis through distinct pathways 〔J〕. Immunol, 1994; 152(10)∶1751

　　8，Nagata S, Golstein P. The Fas death factor 〔J〕. Science, 1995; 267(5203)∶1449

　　9，Yans H. Expression of Fas and anti-Fas-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line 〔J〕. Hepatol, 1996; 25(4)∶454

　　10，Ouir R. Fas antigen-mediated apopatsis of ovarian surface epithelial cells 〔J〕. Endocrinology, 1997; 138(11)∶4558

(1999-05-10收稿，1999-12-30修回)