正常乳腺及乳腺癌中Fas与FasL的表达及意义
肿瘤防治杂志 2000年第6期第17卷 基础研究
作者：张德江 陈柯 王永征
单位：张德江（绍兴市312000 浙江省绍兴市人民医院普外科）；陈柯 王永征（合肥市230001 安徽省立医院）
关键词：乳腺肿瘤；Fas；FasL；免疫组化
【摘要】 目的：了解凋亡相关基因 Fas、FasL 在正常乳腺组织、原位癌、浸润性癌中的表达，分析其在乳腺癌的发生、发展中的作用。方法：利用免疫组化 S-P 法检测64例乳腺癌及30例正常乳腺组织 Fas、FasL的表达。结果：正常乳腺上皮、原位癌、浸润性癌中 Fas、FasL 蛋白表达阳性率分别为33.33%、57.89%、77.78%和0、100%、100%。结论：(1)Fas 蛋白的表达与乳腺癌的恶性进展相平行，提示 Fas 可能成为一个有意义的预后指标。(2) FasL 蛋白的异常表达可能参与了乳腺癌的发生，并与乳腺癌的浸润和转移有关。
中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1009-4571(2000)06-0585-03
Expression of Fas and FasL in normal breast epthelia cells,carcinoma in situ and invasive breast cancer and their significance
ZHANG De-jiang，CHEN Ke，WANG Yong-zheng.
(Department of General Surgery,People's Hospital,Shaoxing,Zhe jiang.Shaoxing 312000)
【Abstract】 Objective：To detect apoptosis-associated genes Fas and FasL expressison in normal epthelia cells, carcinoma in situ and invasive breast cancer.We evaluated their possible role in the carcinogenesis and development of breast cancer was evalualed.Methods:Immunohistochemical method was used to detect the expression of Fas and FasL in 64 cases of breast cancer tissues and 30 cases of the normal breast tissues.Results:In normal breast tissues ,carcinoma in situ and invasive cancer,the positive rates of Fas and FasL Were 33.33%,57.89%,77.785% and 0,100%,100%,respectively.Conclusions:(1)The expression of Fas is parallel with the extent of tumor progress,and it suggests that Fas may be a reliable prognosti factor of breast cancer.(2) The abnormal exprssion of FasL may be take part in breast carcinogenesis.Furthermore,it is associated with tumor's infiltration and metastasis.
【Key words】 breast neoplasms;fas;fasL;immunohistochemistry
细胞凋亡的重要性已被广泛接受。它是去除畸变细胞、发育不良细胞的一条共同的终末途径，是多细胞生物正常发育成熟和维持正常生理过程所必须的。我们对凋亡相关基因 Fas、FasL 在正常乳腺组织、原位癌、浸润癌中的表达进行了检测与比较分析，以期有利于对乳腺癌认识的深化，并为将来治疗方案的制订提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集安徽省立医院病理科1995～1999年乳腺癌手术切除标本64例。按 WHO 组织乳腺癌分类标准［1］重新认定分型，计导管内原位癌19例，浸润性导管癌45例。正常乳腺组织30例(距癌组织4 cm以上)。乳腺癌分期采用 TNM 分期。患者均为女性，年龄35～88岁，平均52岁。术前均未接受放疗或化疗。所有标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片供 HE 染色及免疫组化染色。
1.2 免疫组化染色
Fas多克隆抗体(C-20)、FasL多克隆抗体(N-20)均为美国 Santa Cruz 公司产品(购自北京中山生物技术有限公司)，S-P 免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司。用 S-P 法分别检测组织中 Fas、FasL 的表达。Fas、FasL 抗体滴度均为1∶75，微波抗原修复10 min,其余按试剂盒说明书操作。用已知阳性结肠癌切片作阳性对照，用 PBS 代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断
Fas、FasL 蛋白阳性染色均为胞浆、胞膜出现棕黄-棕褐色均匀颗粒。观察10个高倍镜视野，计数阳性肿瘤细胞，以百分率表示。根据阳性肿瘤细胞所占比例分为4级：≤5%为(-)，6%～25%为(+)，26%～50%为(＋＋)，＞50%为(＋＋＋)。
1.4 统计学处理
各检验指标在组织分型间的差异性用秩和检验，率的比较用 χ2 检验。
2 结果
在正常乳腺组织中，Fas 阳性细胞分布散在而稀少。乳腺原位癌和浸润性癌中表达明显增高，且着色较强。FasL 蛋白在正常乳腺上皮中无表达，而在乳腺癌中广泛表达，随肿瘤的浸润其染色强度明显增强(表1)。
表1 乳腺癌及正常乳腺组织 Fas 和 FasL 蛋白表达
| 类别 |
n |
Fas |
|
FasL |
| - |
+ |
＋＋ |
＋＋＋ |
阳性率(%) |
- |
+ |
+ |
+++ |
阳性率(%) |
| 正常乳腺组织 |
30 |
20 |
5 |
4 |
1 |
33.33 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0.00 |
| 原位癌 |
19 |
8 |
3 |
5 |
3 |
57.89 |
0 |
8 |
7 |
4 |
100.00 |
| 浸润性癌 |
45 |
10 |
7 |
9 |
19 |
71.88 |
0 |
10 |
12 |
23 |
100.00 |
经秩和检验，从正常乳腺上皮→原位癌→浸润性癌，Fas 蛋白表达率呈递增趋势，P＜0.05。FasL 在原位癌和浸润性癌中均表达，随肿瘤浸润表达强度增加(P＜0.05)。经 χ2检验，Fas 蛋白表达率与肿瘤大小有关，随肿瘤增大而增强(P＜0.05)。Fas 蛋白表达与淋巴结转移、TNM 分期无相关性。见表2。经秩和检验，淋巴结转移组乳腺癌 FasL 表达强度高于非淋巴结转移组(P＜0.05)。FasL 表达与肿瘤大小及临床 TNM 分期无相关性(图1～4)。
表2 乳腺癌中 FasL 蛋白表达与其临床指标
| 组别 |
n |
FasL |
| 总表达
例数 |
(+) |
(＋＋) |
(＋＋＋) |
阳性率(%) |
| 肿瘤直径(cm) |
|
| ≤2 |
26 |
15 |
10 |
8 |
8 |
57.70 |
| ＞2 |
38 |
31 |
8 |
11 |
19 |
81.58※ |
| 淋巴结转移 |
|
| 有 |
35 |
26 |
6 |
11 |
18 |
74.29 |
| 无 |
29 |
20 |
12 |
8 |
9※ |
68.97 |
| TNM 分期 |
| Ⅰ |
29 |
20 |
9 |
13 |
7 |
68.97 |
| Ⅱ |
15 |
10 |
5 |
3 |
7 |
66.67 |
| Ⅲ |
18 |
14 |
4 |
2 |
12 |
77.78 |
| Ⅳ |
2 |
2 |
0 |
1 |
1 |
100.00 |
注：※与前一组比较P＜0.05。
图1 导管内原位癌 Fas 蛋白阳性染色(SP×400)
图2 浸润性导管癌 Fas 蛋白阳性染色(SP×400)
图3 导管内原位癌 FasL 蛋白阳性染色(SP×400)
图4 浸润性导管癌 FasL 蛋白阳性染色(SP×400)
3 讨论
目前认为，肿瘤是致癌因子通过基因调控而导致的细胞异常增殖和/或细胞凋亡失衡的结果。细胞表面的 Fas 蛋白是一种凋亡信号受体，表达 Fas 的细胞在用 Fas 抗体处理或与自然存在的 FasL 相互作用后，可触发 Fas 所在靶细胞在数小时内凋亡。本研究中 Fas 蛋白表达自正常乳腺组织(33.33%)→原位癌→浸润性癌呈逐渐升高趋势(P＜0.05)，提示 Fas 蛋白表达与恶性程度相平行(P＜0.05)。Fas 蛋白表达率与肿瘤大小有关(P＜0.05)，随肿瘤增大而增强。以上提示 Fas 可能成为一个有意义的预后指标。本研究中 Fas 蛋白表达率较 Hhnel 等［2］的报道为高，可能原因在于其取材包含上皮组织较少或者阳性细胞在乳腺上皮中表达较低，此两种因素均可导致 Fas-mRNA 表达比真实水平偏低。乳腺癌中 Fas 高表达的原因尚不清楚。其可能的机制为肿瘤反应性淋巴细胞、单核细胞释放细胞因子所致。体外试验证实 TNF-α、INF-γ等均可诱导肿瘤细胞表达 Fas 蛋白［3］。
本研究发现，FasL 蛋白在正常乳腺组织中无表达，而在乳腺癌中表达，且随原位癌→浸润癌的发展 FasL 表达强度逐渐增强(P＜0.05)，在肿瘤细胞周边浸润区更强；淋巴结转移性乳腺癌 FasL 表达较非转移者明显增高(P＜0.05)。提示 FasL 的异常表达可能参与了乳腺癌的发生、发展，并与其转移有关。本研究还发现，在某些肿瘤细胞，不仅表达 FasL，而且表达 Fas。其周边肿瘤反应性淋巴细胞在表达 Fas 的同时，也表达 FasL。那么，为什么淋巴细胞与肿瘤细胞遭遇后，Fas/FasL 相互作用导致淋巴细胞死亡，而不是肿瘤细胞死亡?其可能的机制为：①肿瘤细胞凋亡敏感性的下调。表达 FasL 的淋巴细胞与表达 Fas 的肿瘤细胞接触，原本能引起肿瘤细胞死亡，但由于抑制凋亡基因 Bcl-2、FAP-1、Bcl-XL 等过表达，或/和促凋亡基因 Bax、p53 失表达、突变，导致肿瘤细胞对 Fas 介导的凋亡敏感性淋巴细胞相对低。结果是淋巴细胞死亡而不是肿瘤细胞死亡。②肿瘤分泌因子的参与。如 TGF-β、IL-10、VEGF 等。这些因子可以抑制淋巴细胞分泌具有杀伤效应的分子，如 TNF、IFN-γ、IL-2、穿孔素、颗粒酶等。③可溶性 Fas (sFas)的作用。肿瘤细胞也可以分泌 sFas 逃避机体通过 Fas/FasL 途径的免疫清除机制。Midis 等已在乳腺肿瘤浸出物中证实 sFas 的存在［4］。④肿瘤细胞 Fas 抗原突变以逃避特异性淋巴细胞的攻击。⑤肿瘤细胞可通过对活化的免疫细胞表面 FasL 的作用阻止凋亡。即阻止淋巴细胞膜结合形式的 FasL 的有效切割与活性 FasL 的有效释放，而其自身可释放溶解状态的 FasL (sFasL) 介导淋巴细胞凋亡［5］。
参考文献：
［1］ Azzopardi JG,Chepick OF,Hartmann WH,et al.The World Health Organization histological typing of breast tumors-second edition［J］.Am J Clin Pathol,1982,78:806-816.
［2］ Hhnel E,Harvey J,Robbins P,et al.Hormone-regulated genes-(pS2,PIP,FAS) in breast cancer and nontumoral mammary tissue［J］.Pathobiology，1995,62:82-89.
［3］ Michacel W,Karl F,Peter G,et al.Anti-Fas/Apo-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells［J］.J Clin Invest,1994,94:954.
［4］ Midis GP,Shen Y,Schaub LBO.Elevated soluble Fas (sFas) levels in nonhematopoietic human malignancy［J］.Cancer Res,1996,56:3870-3874.
［5］ Kayagaki N.Kawasaki A.Ebata T,et al.Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand［J］.J Exp Med,1995,182:1777
收稿日期：2000-10-10 修回日期：2000-11-15
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