逆转录聚合酶链反应技术检测人肝癌nm23-H1基因mRNA表达

中国普外基础与临床杂志 1999年第4期第0卷 基础与实验研究

作者：徐　骁　郑树森　陈　智　梁廷波　张　珉　黄东胜

单位：徐　骁　郑树森　梁廷波　张　珉　黄东胜　浙江医科大学附属第一医院肝胆外科(杭州　310003)；陈　智　浙江医科大学传染病研究所

　　关键词： 肝肿瘤；聚合酶链反应；nm23-H1基因

　　摘要　为探讨人肝癌中肿瘤转移抑制基因nm23-H1的mRNA表达状况，设计特异性引物，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测分析了20例人肝癌组织及相应癌旁肝组织中nm23-H1基因的mRNA表达。结果： 特异性引物能成功扩增nm23-H1基因的几乎整个编码序列； 20例肝癌及癌旁肝组织的RT-PCR结果均为阳性，nm23-H1基因mRNA未发生表达缺失或较大变异现象。由此表明： 本实验建立的RT-PCR方法为进一步定量测定肝癌组织中nm23-H1 mRNA表达水平奠定了基础。

mRNA EXPRESSION OF nm23-H1 GENE IN HUMAN LIVER TUMOR ASSAYED BY REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN REACTION

Xu Xiao, Zheng Shusen, Chen Zhi, et al.

　　Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003

　　Abstract　To investigate the mRNA expression of nm23-H1 gene in human liver tumor. In tumor and corresponding nontumoral liver specimens from 20 patients, nm23-H1 mRNA were examined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method with specific primers. Results: The primers designed in this study could amplified nearly entire coding sequence of nm23-H1 gene. All the samples showed positive expression of nm23-H1 mRNA, indicating there was no expression loss or obvious alteration. Conclusions: The achievement of RT-PCR method lays foundation for quantitative gaugement of nm23-H1 mRNA in liver tumor.

　　Key words　　Liver neoplasm　　Polymerase chain reaction　　nm23-H1 gene

　　肿瘤分子生物学的研究进展，极大地丰富了我们对人肝癌发生、进展和转移的分子机理的认识。肿瘤的转移是一个多基因参与、多步骤的复杂过程，nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因的最佳代表，近年来已引起重视。为此，本实验设计特异性引物，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肝癌组织中nm23-H1 mRNA的表达状况，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本采集

　　收集浙江医科大学附属第一医院20例肝癌标本及其癌旁非肿瘤性肝组织(距离癌肿边缘2 cm以上)，取4例胆石症患者肝组织作为正常对照，标本均经病理检查确诊。将所取标本即刻用液氮冷冻并于-70℃条件下保存待测。

　　1.2　临床资料

　　20例患者均为男性，平均年龄47.9岁，其中19例为肝细胞性肝癌，1例为癌肉瘤。肝细胞性肝癌组织学分型： 梁状型12例，实体型6例，假腺管型1例； 组织学分级：Ⅰ级2例，Ⅰ～Ⅱ级1例，Ⅱ级6例，Ⅱ～Ⅲ级8例，Ⅲ级2例。其中14例(70%)合并肝硬变，18例(90%)HBsAg阳性，14例(70%)血清AFP阳性(＞20 μg/L)，5例(25%)肿瘤包膜完整，12例(60%)伴门静脉癌栓，14例(70%)TNM分期为Ⅳ期。

　　1.3　引物设计与试剂

　　1.3.1 人nm23-H1引物　根据基因序列并参考国外文献^〔1，2〕，自行设计一对引物，由美国Cybersyn公司合成，扩增片段大小为468 bp，该片段存在限制性内切酶Bg1　Ⅱ位点，酶切后可产生333 bp和135 bp两个小片段。引物序列正链：5′ATGGCCAACTGTGAGCGTA 3′，负链： 5′GCCCTCCTGTCATTCATAG 3′。

　　1.3.2 β-肌动蛋白(β-actin)引物　根据Takebe等^〔3〕研究报道设计，由德国Lubeck大学微生物研究所合成，扩增片段大小为224 bp。引物序列正链：5′ TTCCAGCCTTCCTTCCTGG 3′， 负链：5′ TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT 3′。

　　1.3.3 试剂　TRI_zol试剂、逆转录酶(M-MLV)、Taq酶及限制性内切酶Bg1 Ⅱ分别系美国BRL和Promega公司产品。

　　1.4　总RNA提取及RT-PCR检测

　　肝组织总RNA经TRI_zol提取后，逆转录合成nm23-H1 cDNA第1链，再行PCR扩增。PCR体系：10 μl cDNA模板、5 μl 10×PCR buffer，5 μl 2 mmol/L dNTPs、4 μl 25mmol/L Mg²⁺、各0.2 μl的一对nm23-H1引物(工作浓度为0.4 μmol/L)、1.5 U Taq酶、26 μl灭菌双蒸水。最后加石蜡油50 μl。PCR程序：94℃变性2分钟后，以94℃变性1分钟、50℃退火1分钟和72℃延伸45秒3步作为一个循环，共30个循环，最后1次72℃延伸5分钟。反应产物取10 μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。所有产物需经限制性内切酶Bg1 Ⅱ酶切确认。

　　2　结果

　　总RNA提取后，经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下清晰显示18s和28s两条带；经紫外分光光度计测定吸光度，A260/280值大于1.8，符合要求。RT-PCR产物电泳后约在468 bp处出现条带，经Bg1 Ⅱ酶切后约在333 bp和135 bp处出现条带，证实nm23-H1 mRNA RT-PCR扩增成功(见图1)。20例肝癌标本经检测，表达均为阳性，仅1例标本电泳片段大小有轻微差异，未见基因mRNA表达缺失或较大片段变异。4例正常对照均扩增阳性(见图2)。

图1　nm23-H1基因RT-PCR产物及Bg1 Ⅱ酶切结果

　　M： 分子量标准参照物； T： 肝癌标本； N： 癌旁对照。泳道2显示大小为468 bp的nm23-H1 mRNA RT-PCR产物，泳道1显示该产物被Bg1 Ⅱ酶切成大小分别为333 bp和135 bp的片段。

图2　肝癌及正常对照肝组织中nm23-H1基因RT-PCR产物电泳结果

　　B： 空白对照； C： 正常对照； T： 肝癌标本。RT-PCR产物经电泳分离后，除泳道1有细微差异外，泳道2～5均显示大小一致的片段。

　　3　讨论

　　nm23-H1最早于1988年由Steeg等^〔4〕运用cDNA文库差示杂交等技术，在对小鼠黑色素瘤K-1735不同转移能力细胞株的研究中发现，该基因定位于17q21.33～22，包含5个外显子和4个内含子，编码核苷二磷酸激酶(NDPK)。有研究表明nm23-H1能：①通过NDPK维持细胞内NTP池水平，参与微管聚合/解聚和纺锤体形成；②调节基因转录；③参与细胞增殖；④调节信号传导。一般认为，nm23-H1基因具有等位基因缺失、点突变、扩增等多种变异方式，并与恶性肿瘤的高转移潜能密切相关^{〔1，5，6〕}。Leone等^〔7〕报道多种人类恶性肿瘤中nm23-H1等位基因缺失现象，其中1例结肠癌标本发生一个等位基因缺失，而相应转移灶中两个等位基因均缺失。提示等位基因缺失是一有序过程，一个等位基因缺失后，呈半合子或纯合子状态的肿瘤细胞仍能转录表达mRNA，而两个等位基因缺失则导致mRNA表达丧失，这是高转移、预后不良的标志。Wang等^〔8〕报道1例出现转移的结肠癌的RT-PCR产物缺失了64 bp，并经基因序列分析证实，该基因阅读框架的改变导致异常蛋白合成。

　　肝癌中有关nm23-H1等位基因缺失、基因突变的研究尚未见报道。Yamaguchi等^〔9〕应用免疫组化技术检测发现nm23-H1蛋白表达与肝癌肝内转移呈负相关，但与肿瘤大小、组织学分级、包膜侵犯等指标无关。Boix等^〔10〕应用Northern印迹杂交技术研究了17例孤立小肝癌，发现nm23-H1 mRNA过度表达与肝癌低复发率密切相关。我们检测了20例肝癌，nm23-H1 mRNA表达均阳性。本组60%伴有门静脉癌栓，70%属临床Ⅳ期，作为一个预后高危组，未发现nm23-H1两个等位基因缺失及mRNA较大变异现象，仅1例电泳片段大小有细微差异，有待于基因测序进一步明确。

　　本研究采用RT-PCR技术成功检测到nm23-H1 mRNA表达，具有较高的敏感性和特异性，为进一步定量测定肝癌组织中nm23-H1 mRNA表达水平奠定基础。首先，根据文献报道的人nm23-H1基因序列等相关资料^〔1，2〕，自行设计一对引物，上下游引物分别设计在nm23-H1基因的第2外显子始端和第5外显子末端，扩增片段长达468 bp，包含基因的几乎整个编码序列，故能正确反映nm23-H1 mRNA变异情况。其次，由于基因组DNA中有内含子间隔，因此即便RNA样本中可能存在的微量DNA经PCR扩增，其片段大小与应有产物不符，从而避免假阳性可能。此外，nm23-H1基因第3外显子上存在一个限制性内切酶Bg1 Ⅱ位点(GAAGAT)，为nm23-H1所特别拥有，而nm23-H2等基因缺少该酶切位点^〔2〕。由于酶切位点包含于扩增片段内，且该位点上下游片段长度分别为135 bp和333 bp，故我们通过观察扩增产物酶切后的电泳图谱即可判断是否获得正确产物，排除nm23-H2等基因扩增造成混淆的可能。

　　参考文献

　　1　Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2. Cancer Res, 1991; 51(1)∶445

　　2　Okada K, Urano T, Goi T, et al. Isolation of human nm23 genomes and analysis of loss of heterozygosity in primary colorectal carcinomas using a specific genomic probe. Cancer Res, 1994; 54(15)∶3979

　　3　Takebe Y, Seiki M, Fujisawa J, et al. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5. Mol Cell Biol, 1988; 8(4)∶466

　　4　Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst, 1988; 80(3)∶200

　　5　Caligo MA, Cipollini G, Fiore L, et al. nm23 gene expression correlates with cell growth rate and s-phase. Int J Cancer, 1995; 60(6)∶837

　　6　Steeg PS. Metastasis. Cancer Res, 1995; 36(Suppl)∶650

　　7　Leone A, McBride OW, Weston A, et al. Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer. Cancer Res, 1991; 51(9)∶2490

　　8　Wang L, Patel U, Ghosh L, et al. Mutation in the nm23 gene is associated with metastasis in colorectal cancer. Cancer Res, 1993; 53(2)∶717

　　9　Yamaguchi A, Urano T, Goi T, et al. Expression of human nm23-H1 and nm23-H2 proteins in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1994; 73(9)∶2280

　　10　Boix L, Bruix J, Campo E, et al. nm23-H1 expression and disease recurrence after surgical resection of small hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 1994; 107(2)∶486

(1998-06-13收稿，1999-04-06修回)