您所在的位置:首页 > 专题栏目 > 肝癌专题 > 文献资料 用户登录 新用户注册
肝癌bcl-2基因异常及与p53蛋白表达的关系

肝癌bcl-2基因异常及与p53蛋白表达的关系

中华肝胆外科杂志 1998年第1期第37卷 论著

作者:郭琳琅 肖莎

单位:510282 广州,第一军医大学珠江医院病理科

关键词:肝癌;原癌;基因;;聚合酶链反应;免疫组化

   【摘要】 为探讨bcl-2和p53基因与肝细胞癌的关系,采用半套式原位聚合酶链反应和免疫组化技术原位检测40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因、bcl-2蛋白及突变型p53蛋白的表达。结果显示40例肝细胞癌中6例bcl-2蛋白阳性,发生

  bcl-2基因重排10例,25例p53蛋白阳性,bcl-2蛋白表达与bcl-2/JH融合基因间无相互相对应关系。p53蛋白与bcl-2蛋白表达及bcl-2基因重排间无明显关系。结果说明,bcl-2和p53基因均与肝细胞癌的发生有一定关系。bcl-2/JH融合基因不是引起bcl-2蛋白表达的唯一原因。bcl-2和p53基因在肝细胞癌变过程中无协同作用。

  

  Study on bcl-2 gene abnormality in hepatocarcinoma and its relation with p53

  protein expression Guo Linlang, Xiao Sha. Department of Pathology, Zhujiang hospital,

  first Military Medical University, Guangzhou 510282

  【Abstract】 In order to investigate the relationship between bcl-2 gene and p53 gene

  and hepatocarcinoma, bcl-2/JH fusion gene, bcl-2 protein and mutation type of p53 protein

  were detected in 40 human primary hepatocellular carcinomas (HCC) by seminested in situ

  pCR and immunohistochemistry technique. Six cases were found to have bcl-2 protein

  expression, 10 cases to have bcl-2 gene rearrangement and 25 cases to have p53 protein

  expression. There was no corresponding relation between bcl-2 protein expression and bcl-2

  gene rearrangement. The results showed that bcl-2 and p53 gene might be involved in

  hepatocarcinogenesis. Expression of bcl-2 protein was not caused only by the bcl-2/JH fusion

  gene. There was no synergetic effect between bcl-2 and p53 gene in hepatocarcinogenesis.

  【Key words】 Hepatocarcinoma Oncogene polymerase chain reaction

  immunohistochemistry

  bcl-2基因是一种凋亡相关基因,bcl-2基因断裂、易位与免疫球蛋白重键形成bcl-2/JH融合基因,引起bcl-2基因异常表达,在细胞凋亡过程中起抑制作用。已有报道肝癌细胞无或仅有低水平的bcl-2蛋白表达〔1,2〕。肝癌细胞中有无bcl-2/JH融合基因形成,bcl-2基因异常与p53蛋白异常表达关系如何,国内外尚未见研究报道。我们采用半套式原位聚合酶链反应和免疫组化技术对

  40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因、bcl-2蛋白及p53蛋白进行了原位观察,并对其间关系进行了分析。

材料和方法

  1.标本来源:选自我院手术切除及活检肝细胞癌标本40例,根据Edmondson-

  steiner分类法进行分类,Ⅰ级7例,Ⅱ级18例,Ⅲ~Ⅳ级15例。正常肝7例作对照研究。标本经福尔马林溶液固定,石蜡包埋,4μm切片。

  2.免疫组织化学染色:试剂:第一抗体鼠抗bcl-2单克隆抗体和鼠抗p53单克隆抗体与SP染色试剂盒均为福州迈新Maxim公司产品。方法:采用柠檬酸-SP免疫组化法进行,在加第一抗体前,进行微波修复抗原。将切片放入0.01mol柠檬酸缓冲液(pH=6.0)内,于微波炉中“解冻”档加热10min,其它步骤按常规免疫组化方法进行。每例均设阴性和阳性对照。

  3.引物和探针设计:依据t(14;18)断裂点集中于bcl-2基因上的两个热点,设计两对半引物和1对寡核苷酸探针,探针采用生物素标记,由中科院上海生物工程研究所合成。主要断裂区外引物(mbr)A:5’-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3’,次要断裂区外引物(mcr)B:5’-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3’,主要断裂区内引物(mbr)C:5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’,次要断裂区内引物(mcr)

  d:5’-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3’,免疫球蛋白重链基因引物(JH):5’-

  aCCTGAGGAGACGGTGACC-3’。探针序列:主要断裂区mbr:5’-CCCTCCT

  gCCCTCCTTCCG-3’,次要断裂区mcr:5’-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3’。

  4.半套式原位PCR扩增:①前处理:二甲苯常规脱蜡,乙醇系列复水。0.1

  mol HCl 10min,PBS洗,10μg/ml蛋白酶K,10min。置扩增仪平台上,98℃ 2min,

  hC-200多功能原位PCR扩增仪由西安飞机工业公司和第四军医大学研制。②原位

  pCR扩增:Taq DNA聚合酶和dNTP为华美生物工程公司产品。反应液体积20μl,其中4×dNTP 2μl,Taq酶1.5U,10×buffer 2μl。第一轮扩增用引物A、JH扩增

  mbr,B、JH扩增mcr形成的融合基因。将反应液滴加在切片上,加盖玻片。反应条件:94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min,25个循环,最后72℃延伸10min。

  取扩增产物2μl行第二轮扩增,用引物C、JH扩增mbr,D、JH扩增mcr形成的融合基因,循环条件同上,扩增35个循环。

  5.原位杂交:两轮扩增后揭去盖玻片,乙醇梯度入水,4%多聚甲醛10 min。

  滴加杂交液40μl(探针浓度80pmol/L),95℃变性10min,置湿盒内37℃过夜。

  免疫学显色,2%正常牛血清及0.3%Triton X-100封闭非特异性抗原,滴加二抗,用生物素碱性磷酸酶显色系统显色(福州迈新Maxim公司产品)。核酸杂交阳性信号位于细胞核内,为紫蓝色,呈颗粒状。

  6.阳性对照:已知阳性滤泡性淋巴瘤细胞。阴性对照:①空白对照,仅作HE染色。②PCR反应液中不加dNTP或Taq酶。③杂交液中不加探针。

结 果

  1.肝癌和癌旁肝细胞bcl-2蛋白表达:40例肝细胞癌中6例阳性,阳性率为

  15%,Ⅰ级1例,Ⅱ级3例,Ⅲ~Ⅳ级2例。各组织学分级间无明显差异(P>0.05)。

  8例癌旁肝细胞阳性,阳性率为20%。7例正常肝中肝细胞为阴性。

  2.肝癌和癌旁肝细胞bcl-2/JH融合基因检测:40例肝细胞癌bcl-2/JH融合基因阳性10例,阳性率为25%。其中Ⅰ级1例,Ⅱ级5例,Ⅲ~Ⅳ级4例;各组织学分级间无明显差异(P>0.05)。bcl-2断裂点发生在mbr和mcr区域各有5例。癌旁肝细胞中2例出现bcl-2/JH融合基因,发生在mbr和mcr区域各1例。7例正常肝组织无一例bcl-2/JH融合基因形成。

  3.肝癌和癌旁肝细胞突变型p53蛋白表达:40例肝癌中25例p53蛋白阳性,阳性率为52.5%,癌旁组织阳性率为12.5%(5/40)。

  4.Bcl-2蛋白表达与bcl-2基因重排的关系:6例bcl-2蛋白阳性的肝癌细胞中1例发生bcl-2基因重排,34例bcl-2蛋白阴性病例中9例出现bcl-2基因重排,两组间无明显差异(P>0.05)。

  5.p53蛋白与bcl-2蛋白表达及bcl-2基因重排的关系:25例p53蛋白阳性病例中4例bcl-2蛋白阳性、6例出现bcl-2/JH融合基因,15例p53蛋白阴性病例中2例bcl-2蛋白阳性、4例出现bcl-2/JH融合基因,两组比较无明显差异(P>0.05)。

讨 论

  本研究40例肝癌细胞中bcl-2蛋白的阳性率为15%,癌旁组织20%,正常肝细胞为阴性反应。Charlotte等〔1〕观察15例肝细胞癌中无一例bcl-2阳性。王万忠等〔2〕在37例肝细胞癌中发生6例bcl-2蛋白阳性表达,阳性率16.2%,癌旁组织35.1%,与本文研究资料近似。本研究还显示,40例肝细胞癌中10例出现bcl-

  2/JH融合基因,阳性率为25%,发生在mbr和mcr区域分别有5例,各占50%。bcl-2融合基因形成一直被认为是滤泡型淋巴瘤发生的重要分子生物学基础〔3,4〕

  肝细胞癌中检测到bcl-2/JH融合基因,提示bcl-2基因重排并非淋巴瘤的特异性改变;mbr和mcr区域可能同为bcl-2基因在肝细胞癌的两个重要断裂区。分析

  bcl-2蛋白表达与bcl-2/JH融合基因形成的关系,未发现两者间存在相互对应关系。

  说明bcl-2/JH融合基因不是致bcl-2蛋白表达的唯一原因。

  已有报道p53基因突变是肝癌的一种常见现象〔5,6〕。本组资料显示p53蛋白在肝癌中的表达率为52.5%。与已有报道结果近似。研究发现p53基因不仅调节细胞的增殖和分化,还参与细胞凋亡的调节过程〔7〕。突变型p53有抑制细胞凋亡的作用,与bcl-2的功能近似,在大肠癌、乳腺癌等肿瘤的研究中发现p

  53和bcl-2蛋白的表达呈负相关关系,p53对bcl-2蛋白表达有下调作用〔8~10〕

  本研究对p53和bcl-2基因在肝癌中的关系进行分析,结果显示p53蛋白阳性组和

  p53阴性组bcl-2蛋白表达及bcl-2/JH融合基因检出率无明显差异,提示p53和

  bcl-2基因在肝细胞癌变过程中无协同作用。

  本研究还显示癌旁肝细胞中也有p53和bcl-2蛋白表达及bcl-2/JH融合基因形成,正常肝细胞均阴性,表明p53和bcl-2蛋白表达及bcl-2基因重排存在于肝癌的发生发展过程中,但阳性细胞是否表示细胞已处于癌前状态尚需进一步证实。

参 考 文 献

  1Charlotte F, LHermine a, Martin N, et al. Immunohistochemical detection of

  bcl-2 protein in normal and pathological human liver. Am J Pathol, 1994, 144: 450.

  2王万忠,王家耀,杜德利.bcl-2癌基因在肝肿瘤表达.中华医学杂志,1996,

  76:470.

  3Tsujimoto Y, Ikegaki N, Croce CM, et al. characterziation of the protein product of

  bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma. Oncogene, 1987, 2: 3.

  4王洁,李甘地,刘正明,等.滤泡型淋巴瘤的t(14;18)染色体易位与bcl-2蛋白的表达.中华病理学杂志,1995,24:337.

  5刘孟珉,吴孟超,余龙,等.肝细胞癌p53基因突变和蛋白表达的研究.癌变.畸变.突变.1996,8:257.

  6蔡德巍,高长泽,王能进.C-myc基因和p53蛋白在肝细胞癌中的表达.中华病理学杂志,1994,23:100.

  7Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet,1993, 341: 1251.

  8皋岗湘,丁华野,邓永红,等.乳腺癌组织bcl-2、p53和cerbB-2蛋白表达和相关关系及意义.中华病理学杂志,1996,25:165.

  9Halder S, Negrini M, Monne M, et al. Down-regulation of bcl-2 by p53 in breast cancer

  cell. Cancer Res, 1994, 54: 2095.

  10Sinicrope FA, Ruan SB, Cleary KR, et al. bcl-2 and p53 oncoprotein expression during

  colorectal tumorigenesis. Cancer Res,

  1995, 55: 237.

  (收稿:1997-07-14)


页面功能 参与评论】【字体: 打印文章关闭窗口
下一编:40岁以下青壮年原发性肝癌介入治疗临床分析
焦点新闻
·慢性粒细胞白血病p53基因功能检测
·p16/MTS1基因缺失在急性淋巴细胞白血病发病中的作用
·RT-PCR检测白血病患者mdr1表达的临床研究
·慢性粒细胞白血病急变相关基因研究进展
·急性淋巴细胞白血病p16基因及P16蛋白失活与临床相关性
·儿童急性白血病p16基因的缺失和突变及其意义
·极限稀释PCR法对急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测
·儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病细胞的DNA定量研究
温馨提示:如果您怀疑自己有某种健康问题,可到健康社区交流咨询或尽快去医院就医治疗。

栏目列表