CD28/CD80和CD2/CD58活化PBLs作用肝癌细胞的表型分析与TCR Vβ基因亚家族的优势取用
世界华人消化杂志 1999年第12期第7卷 研究原著
作者：肖兰凤 罗利琼 邹奕 黄树林
单位：广东省药学院分子生物学研究室 广东省广州市 510224
关键词：McAb共激活；肝癌细胞；膜分子；TCR Vβ基因
摘 要 目的 采用抗CD28,CD80,CD2及CD58分别刺激健康人PBLs后作用肝癌细胞，对作用前后PBLs的表型变化及TCR vβ基因亚家族的表达水平进行探讨.方法 用FACS分析作用肝癌细胞前后PBLs表型变化，并用RT-PCR-Southern印迹分析其TCR vβ1～20的表达水平及特征.结果 健康人PBLs作用肝癌细胞后CD3和CD8分子表达比作用前明显增高，而CD4分子无显著变化．健康人PBLs分别加IL-2,PHA,抗CD3和CD3+CD28,CD28+CD80,CD2+CD58作用肝癌细胞(BEL-7402)前表达水平平均约5%，作用BEL-7402后表达水平约13%～25%，其特征为Vβ7增高.结论 在癌抗原的参与下，McAb共刺激的T细胞活化，TCR接受APC提呈的相应抗原的刺激，具有该TCR的淋巴细胞迅速增殖而成为针对抗原的T细胞克隆，发挥其识别和杀伤癌细胞的作用.
中国图书馆分类号 R735.7 R392.11
Study of the phenotype of PBLs activated by CD28/CD80 and CD2/CD58 and acting with hepatoma cells and the restricted usage of TCR Vβ gene subfamily
XIAO Lan-Feng，LUO Li-Qiong，ZOU Yi and HUANG shu-Lin(The Research Center of Molecular Biology，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou510224，Guangdong Province，China)
Abstract AIM To study the difference of the phenotype of PBLs and the expression of TCR Vβ subfamily in liver before and after stimulation by anti-CD28，anti-CD80，anti-CD2 and anti-CD58 and then acting with hepatoma cell.METHODS The change in the phenotype of hepatoma cells was studied by RT-PCR and Southern blot.RESULTS The level of CD3 and CD8 of PBLs were significantly increased after acting with hepatoma cells，while there was no change in CD4．The mean level of TCR Vβ of PBLs increased from 5% to 13%-25% after acting with hepatoma cell，especially TCR Vβ7 increased dramatically.CONCLUSION With tumor cell antigen，T cells were activated by the stimulation of McAb．The T cells with antigen specific TCR amplified into clone，recognized and killed tumor cells.
Subject headings McAb costimulate; hepatoma cell;membrane molecule; TCR Vβ gene
0 引言
免疫细胞的相互作用及杀伤细胞识别靶细胞的过程中，除了需要对特异性抗原的识别作用外，还需要粘附分子的相互作用．CD28与TCR激活相似的传导途径，但只有在共刺激途径激活后，TCR途径才能达到最佳激活，也就是CD28维持了TCR诱导的第二信使的作用．抗CD2共激活PBLs作用肝癌细胞前后的膜分子CD3，CD4，CD8与T细胞膜表面的抗原受体(TCR)Vβ基因表达水平与关系进行探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 淋巴细胞的分离培养［1］：健康人外周血(PBLs)100mL(广州血液中心)，Ficoll密度梯度分离，以1×106mL-1悬浮于RPMI1640液中(含10%小牛血清)，(IL-2 200U/mL，CD3 McAb 70ng/mL，CD28，CD80，CD2，CD58 mcAb均为2μg/5×105个细胞)，37℃，5% CO2孵箱中培养4d．肝癌细胞(BEL-7402)培养［2］：肝癌细胞系(BEL-7402)由中山医科大学肿瘤所赠．用0.25%胰蛋白酶消化，加2mL 1640液吹散细胞，再加入含10%小牛血清的1640液，共10mL．在37℃，5% cO2孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的淋巴细胞培养4d～6d．单克隆抗体(McAb)来源：CD28，T细胞亚群，干粉；CD80，B细胞亚群，干粉；CD3，成熟T细胞；CD4+，辅助/诱导T细胞；CD8+，抑制/细胞毒性T细胞；CD2，干粉；CD58，干粉(均购自Immunotech公司).
1.2 方法 流式细胞仪(Epics．Rcoulter公司)加入20μL单抗(CD3，CD4+，CD8+)设对照1管(鼠Ig-FITC20μL再加入5×105淋巴细胞100μL，4℃孵育30min后加PBS 1mL，1800r/min离心5min，去上清，再加入1mL pBS上机)．RNA提取，引物及cDNA合成，RT-PCR检测TCR Vβ基因，探针标记与Southern杂交化学发光X-线片自显影(Lumi-phos530)，图象分析：Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件(1.57版本)在计算机上进行处理，用公式：(Vβ的密度)×100/(Vβ1～22)的累积密度，计算TCR vβ的相关频率．见文献［3］.
2 结果
2.1 用FACS检测抗 CD3/CD28；CD28/CD80；CD2/CD58诱导PBLs作用肝癌细胞BEL-7402前后的T细胞膜表面分子CD3，CD4，CD8表达(%)，表1.
表1 对照组、McAb共激活PBLs组及McAb共激活PBLs作用肝癌细胞组膜表面分子的表达
| 组别 |
CD3 |
CD4 |
CD8 |
| 对照组 |
| PHA |
25.2 |
10.2 |
22.8 |
| IL-2 |
57.7 |
36.9 |
27.9 |
| CD3 |
57.9 |
37.1 |
26.1 |
| McAb共激活PBLs组 |
| CD3+CD28 |
55.5 |
33.1 |
28.8 |
| CD28+CD80 |
58.2 |
35.6 |
28.9 |
| CD2+CD58 |
64.9 |
42.1 |
21.7 |
| McAb共激活PBLs作用肝癌细胞组 |
| CD3+CD28 |
77.5 |
33.8 |
47.8 |
| CD28+CD80 |
90.9 |
39.5 |
60.2 |
| CD2+CD58 |
83.9 |
45.7 |
40.6 |
2.2 分离健康成人PBLs 用McAb共刺激后作用肝癌细胞前后采用RT-PCR-Southern印迹分析TCR vβ 基因亚家族1～20，其表达特征均为Vβ7，图1.
图1 TCR Vβ基因在不同来源PBLs中的表达.
1.健康人PBL；2.健康人PBL经PHA刺激后；3.健康人PBL与IL-2共育4a,5a,6a,7a．分别用抗CD3，CD3+CD28，CD28+CD80，CD2+CD58共激活PBL4b,5b,6b,7b．McAb共激活PBL作用肝癌细胞(BEL-7402).
2.3 采用RT-PCR-Southern印迹、扫描定量分析McAb共刺激PBLs作用肝癌细胞BEL-7402前后的TCR vβ1-20亚家族表达水平(%)，表2.
表2 McAb共刺激PBLs作用肝癌细胞BEL-7402前后的TCR vβ1-20亚家族表达水平 (%)
| Vβ |
1 |
2 |
3 |
4a |
4b |
5a |
5b |
6a |
6b |
7a |
7b |
| 1 |
3.34 |
5.49 |
2.29 |
2.94 |
3.41 |
5.17 |
3.34 |
4.85 |
1.68 |
0.82 |
1.14 |
| 2 |
1.19 |
3.21 |
1.76 |
2.34 |
3.66 |
5.81 |
2.13 |
4.12 |
2.29 |
2.00 |
2.15 |
| 3 |
8.00 |
5.90 |
3.99 |
5.11 |
4.84 |
6.26 |
1.86 |
6.11 |
3.23 |
3.09 |
2.82 |
| 4 |
1.45 |
3.15 |
3.08 |
1.86 |
3.84 |
5.13 |
1.65 |
7.23 |
3.30 |
3.05 |
2.78 |
| 5.1 |
1.87 |
3.44 |
2.09 |
1.84 |
3.78 |
5.82 |
1.48 |
6.91 |
3.82 |
3.92 |
2.52 |
| 5.2 |
1.41 |
3.70 |
2.36 |
1.88 |
4.21 |
4.72 |
1.40 |
6.35 |
3.98 |
4.13 |
2.40 |
| 6 |
7.27 |
10.07 |
7.25 |
7.67 |
4.75 |
3.77 |
1.55 |
4.86 |
3.98 |
4.74 |
4.71 |
| 7 |
7.28 |
7.88 |
7.45 |
5.14 |
11.20 |
2.48 |
15.86 |
1.73 |
24.13 |
10.44 |
25.41 |
| 8 |
3.97 |
3.97 |
4.58 |
2.65 |
5.08 |
3.80 |
1.56 |
6.01 |
5.36 |
4.98 |
2.88 |
| 9 |
5.20 |
3.12 |
4.40 |
7.25 |
5.09 |
4.66 |
2.30 |
4.60 |
3.26 |
5.11 |
2.28 |
| 10 |
8.01 |
3.03 |
8.62 |
7.57 |
3.75 |
4.68 |
4.71 |
3.71 |
4.14 |
5.17 |
2.59 |
| 11 |
4.34 |
3.32 |
4.68 |
2.26 |
4.21 |
4.78 |
11.64 |
4.60 |
3.38 |
5.38 |
2.06 |
| 12 |
2.78 |
4.66 |
2.67 |
6.50 |
4.74 |
4.49 |
2.60 |
5.63 |
2.87 |
5.24 |
2.96 |
| 13.1 |
5.82 |
4.49 |
4.67 |
5.17 |
4.58 |
4.95 |
2.39 |
6.04 |
3.80 |
5.29 |
3.88 |
| 13.2 |
1.23 |
2.99 |
3.20 |
3.83 |
4.28 |
4.72 |
2.71 |
4.86 |
2.79 |
4.85 |
7.33 |
| 14 |
8.00 |
3.52 |
7.90 |
6.75 |
4.97 |
4.08 |
3.04 |
3.60 |
2.78 |
4.91 |
2.69 |
| 15 |
7.36 |
10.40 |
2.98 |
6.03 |
4.74 |
3.79 |
8.52 |
4.37 |
4.33 |
5.14 |
3.72 |
| 16 |
2.00 |
3.05 |
6.06 |
6.22 |
4.30 |
4.17 |
3.88 |
4.21 |
3.47 |
4.93 |
4.07 |
| 17 |
1.76 |
3.03 |
2.30 |
2.68 |
4.62 |
3.31 |
6.19 |
3.69 |
3.99 |
4.93 |
5.16 |
| 18 |
3.27 |
2.98 |
3.08 |
4.55 |
3.99 |
3.53 |
5.32 |
1.75 |
4.14 |
4.40 |
5.09 |
| 19 |
7.06 |
3.63 |
7.02 |
5.18 |
3.79 |
4.43 |
6.91 |
1.75 |
4.17 |
3.78 |
5.83 |
| 20 |
7.38 |
4.97 |
7.57 |
4.60 |
2.17 |
5.42 |
8.95 |
3.04 |
5.13 |
3.71 |
5.51 |
注：序号1，2，3，4a～7b注释见图1.
3 讨论
使用McAb共刺激PBLs作用癌细胞有增强双信号的作用，有助于肿瘤抗原的识别，和肿瘤免疫性的增加及达到杀伤肿瘤细胞的目的.
CD3分子表达在人全部T细胞上，并与细胞识别抗原受体形成TCR/CD3复合物．TCR特异性识别Ag，而TCR与Ag结合后所产生的活化信号是由CD3分子传递到T细胞内部［4，5］．因此从我们的结果可以看出，McAb共刺激PBLs作用癌细胞后膜分子CD3和TCR vβ基因表达较作用前高(表1，表2)，说明TCR与CD3分子表达关系密切.
CD4分子主要功能协助Th细胞识别APC细胞表面外来抗原，当我们用共刺激物激活PBLs作用BEL-7402前后发现CD4分子的表达无显著差异．在作用前CD4比CD8表达高，而作用肝癌细胞后则CD8分子表达比CD4高，从而提示CD8细胞在杀伤肿瘤细胞时起主导作用，尤其CD28+CD80共刺激PBLs作用癌细胞后表达显著增高(表1)，通过McAb cD28+CD80共激活诱导PBLs作用肝癌细胞前后的TCR Vβ基因表达比较(表2，6a/6b)作用后的表达水平显著增高(1.73/24.13%)，结果证实CD28与B7(CD80)相互作用对T细胞的激活是非常重要的，而且与膜表面分子表达相对应．Ag与TCR结合实际上仅仅是免疫反应的开始，只有当APC表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28作为第二刺激信号，T细胞才被激活，机体内才能产生具有抗肿瘤特异性和细胞毒活性的T淋巴细胞，达到特异性攻击肿瘤的作用［6，7］．本文结果中CD2+CD58组作用癌细胞后膜分子CD3，CD8比作用前高(表1)，TCR vβ基因表达也显著增高(表2，7a/7b)．CD2与LFA-3为与CTL活性相关的另一对细胞粘附因子，其相互作用促进T细胞与其他细胞结合从而扩大免疫应答反应，以提高对肿瘤免疫治疗的效果．由此可见McAb共激活T细胞作用癌细胞将有望成为肿瘤治疗中的新的手段.
国家自然科学基金39770698和广东省自然科学基金980838资助.
作者简介：肖兰凤，副教授，1978年毕业于湖北医科大学，现于广东药学院从事肿瘤生物治疗的研究.
通讯作者 黄树林，510224，广东省药学院分子生物学研究室.
参考文献
1 Boquan J，Kai S．The groups and subgroups of lymphocytes．Jin Boquan．Cytology and Molecular Immunology．Xi＇an: The World Publishing Corporation，1995:259-286
2 Huang SL，Xiao LF，Luo LQ．The study of the phenotype of PBLs that costimulated by McAb．Chinese Journal of Immunology，1997;13(Suppl):16-18
3 Huang SL，Ming WY，Luo LQ，Fu Q．Selected amplification of TCR Vβ gene fragment of PBLs that infected by HSV-2．Shanghai Journal of Immunology，1997;17:98-100
4 Nicole B，Mark E，Anne K．Activated T cells from draining lymph nodes and an effector site differ in their responses TCR stimulation．J Immunol，1997;159:1182-1190
5 Linda AL，Chan DC，Jingyi C．The LAK SH2 phosphotyrosine binding site is critical for efficient TCR- induced protein tyrosine phosphorylation of the ら- chain and IL-2 production．J Immunol，1997;159:2292-2298
6 Lin J．T cell receptor and its appendix．Lin J．Immunology．Beijing: high Education Publishing House，1997:69-84
7 Huang SL，Luo LQ，Xiao LF．Apoptosis of hepatoma cells mediated by McAb costimulated PBLs．Chinese Journal of Immunology，1998;14:154-156
收稿日期 1999-11-04
用户登录 
新用户注册