乙肝病毒和黄曲霉毒素B1在树鼩肝癌形成中的协同作用

　　癌症1999年第18卷第2期

李瑗　苏建家　严瑞琪　覃柳亮杨春　班克臣　王辉云

　　摘　要　目的：动态观察乙肝病毒(HBV)和黄曲霉毒素B1(AFB1)在树鼩原发性肝细胞癌(HCC)形成过程中的作用。方法：成年树鼩按不同处理分为四组：A－HBV＋AFB1组；B－HBV组；C－AFB1组；D－空白对照组。整个实验期间，各组所有动物定期抽血及肝活检。实验于160周结束，处死所有动物。血及肝组织标本进行HBV感染标志及常规病理组织学等检测。结果：第一例HCC于实验99周时出现于A组。A、C组的HCC发生率分别为66.7％和30.0％；HCC的平均出现时间在A、C组分别为120.3±16.6周和153.3±5.8周(P＜0.01)。B、D组于实验结束时均无一例HCC发生，但动态观察中见B组的肝细胞增生结节不仅发生较早而且较多，其中一例于实验130周死亡时已有直径大至0.5cm的增生结节形成。结论：HBV作为独立的致肝癌因素时作用较弱，但HBV与AFB1有很强的协同致肝癌作用；在HCC的形成过程中可能存在着“病毒-化学协同机制”。

　　鼩

　　关键词：肝细胞癌 乙肝病毒 黄曲霉毒素B1 树

　　原发性肝细胞癌(HCC)是包括我国南方地区在内的世界上一些地区最常见的恶性肿瘤之一，预后差，危害极大。HCC在世界范围内明确的地理分布提示某些特殊的危险因素在其形成过程中起作用^[1]。虽已有众多的流行病学及实验室研究资料提示乙肝病毒(HBV)和黄曲霉毒素B1(AFB1)是HCC形成的两大重要因素，但对二者在HCC发生、发展中的相互关系如何，迄今仍所知不多。10年前本研究室曾用低等灵长类动物树鼩进行研究，发现HBV与AFB1有协同致肝癌作用^[2]。本研究通过对HBV及AFB1诱发树鼩肝癌形成过程中的动态观察，证实了上述结果，提示在人类HCC形成过程中可能存在着的“病毒－化学协同机制”。现将实验结果报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物及处理

　　实验用成年树鼩(中缅树鼩滇西亚种)购自中科院昆明医学生物研究所，体重100～160g，单只笼养。所有动物经检测血清ALT、HBsAg及肝组织活检，选出健康动物分为A、B、C、D四组，各组处理如下：

　　A(HBV＋AFB1)组：动物首先分别经股静脉及腹腔接种人HBV感染血清2次，0.5ml/次，2次之间隔3天。接种2周后每周一次抽血检查HBV感染指标。选出HBV感染阳性的动物，随机取部分为B组(见下述)，其余留在A组。A组所有动物于接种后第6周开始喂AFB1，每日150μg/kg.bw，每周喂6日，加入牛奶中由动物舔食。AFB1给至实验105周时停止，动物继续养至实验结束(160周)。

　　B(HBV)组：动物进入本组前接种HBV的血源，量、时间、方法均同A组。经筛选进入本组的HBV感染阳性的动物，除定期检测外，不作其它特殊处理。

　　C(AFB1)组：动物按与A组同样的剂量、方法及开始、结束时间喂饲AFB1。

　　D(空白对照)组：动物不给HBV或AFB1等任何处理，仅按正常饲养方法给予普通饲料、牛奶、水果、饮水等。

　　整个实验期间，各组动物定期抽血(每2～4周1次)检测HBV感染等指标，并定期进行肝活检(每15周1次)。实验至160周结束，处死所有动物。各次活检肝组织、中途死亡及最后处死的动物肝组织均作HBV感染指标及常规病理组织学等检查。

　　1.2　感染血源

　　A、B组动物所用的HBV感染血清取自HBsAg、HBeAg及抗HBc均强阳性的乙肝病毒携带者，其中HBsAg及HBeAg的滴度均在1∶1024以上。

　　1.3　试剂

　　AFB1为美国Sigma化学公司产品；DMSO(用于溶解AFB1)为香港FARCO公司产品；ELISA试剂盒(检测血清HBV指标用)为珠海亚利生物公司产品；HBsAg等免疫组化检测所用的抗体、试剂盒分别购自北京中山生物制品中心及福州迈新生物技术开发中心。上述检测均按试剂盒说明书进行。

　　1.4　肝组织的处理

　　各次活检肝组织、中途死亡及最后处死动物的肝组织每份均取部分冻存于－80℃，其余固定于中性福尔马林，作常规病理组织学及免疫组化等检查。

　　2　结果

　　2.1　一般情况

　　第一例HCC于实验第99周出现于A组。此时各组存活的动物数计为“有效动物数”。各组的有效动物数分别为：A组21只，B组6只，C组10只，D组9只。动物中途死亡的原因在实验99周前多为各种意外(出血、麻醉、窒息等)，在99周以后多死于HCC或衰竭。

　　2.2　AFB1摄入及HBV感染情况

　　经喂饲含AFB1的牛奶105周，A、C组各动物摄入的AFB1总量分别为11.6±0.9mg及11.4±0.8mg，两组间差别无显著性(P＜0.05)。

　　整个实验期间，A、B组动物的血清及肝组织的HBV感染标志的表达多为时隐时现。除个别外，两组各动物均有多次HBV标志阳性的检测结果。

　　2.3　HCC的发生情况

　　HCC的发生在本实验中仅见于A、C组。A组不仅HCC发生率高于C组，且HCC的平均发生时间亦显著短于C组(P＜0.01)。见附表：

附表　A、C组动物发生HCC情况

动物	HCC发生率	HCC出现时间(周，±s)
A组(HBV＋AFB1)
合计	66.7％(14/21)	120.3±16.6*
雄性	50.0％(5/10)	115.0±10.5
雌性	81.8％(9/11)	123.2±19.1**
C组(AFB1)
合计	30.0％(3/10)	153.3±5.8*
雄性	16.7％(1/6)	160.0±1.3
雌性	50.0％(2/4)	150.0±0.0**

注：两组间比较，*P＜0.01；**P＜0.05

　　B组及D组至实验结束时无一例HCC发生。但B组有一例动物在实验130周死亡时，肉眼检查见肝脏表面有二颗直径分别为0.3cm及0.5cm大小的灰白色结节(详见下述)。

　　2.4　肝脏病理组织学检查情况

　　2.4.1　HCC：A、C两组的HCC无论是大体检查还是显微镜检查均无明显差别。HCC的体积大可达直径4cm，小至米粒大小；一般为多发性。HCC镜下呈梁型、腺型或混合型，多为中、低度分化(图1)。癌旁组织常有肝细胞增生灶、增生结节及不典型增生等改变。两组HCC的癌旁肝组织均未见有明显的纤维化改变。各例HCC均未见肝外转移。

图1　C组的一例HCC，腺型。HE染色，10×10

　　2.4.2　肝细胞增生灶(结节)：肝细胞增生灶或结节在A、B及C组均较常见，其中以A、C组为多、以A、B组为早。灶或结节内的肝细胞组成不同，透明肝细胞(PAS染色显示阳性)、嗜酸性或嗜碱性肝细胞及含脂肪空泡的肝细胞均较常见。

　　肝细胞增生灶或结节的出现时间多在实验105周前后，但在A、B组的部分动物可早在接种后30～50周出现。有些早期出现的透明细胞灶经一段时间后自行消失；有些后期持续存在的透明肝细胞结节内混杂有嗜酸性肝细胞或其它类型的增生肝细胞。

　　B组虽至实验结束尚无一例HCC发生，但与对照组(D组)不同，该组有较多的肝细胞增生灶及结节。上面提到肉眼检查见有结节的一例，镜下表现为肝组织内多个肝细胞大增生结节，结节内增生肝细胞密集排列成双行或多行，混杂有少数透明肝细胞，并含腺腔样结构(图2)。B组少数动物还可见肝组织内细纤维条索形成，偶见肝细胞碎屑状坏死。

图2　B组的一例结节，结节内的增生肝细胞排列成双行或多行，并有小的腺样结构。HE染色，10×10

　　D组少数动物在实验后期出现肝细胞增生排列成双行，但未见灶、结节及HCC形成。该组一例动物在接近实验结束时死于滤泡型恶性淋巴瘤。

　　2.4.3　肝脏的其它改变：少量的肝细胞点灶状坏死、汇管区的炎细胞浸润及纤维细胞增生等改变可见于A、B、C各实验组；D组个别动物偶见轻度的上述改变。A、B组的急性及慢性肝炎改变均较轻，仅部分动物肝内炎症反应较明显。A、C组的少数动物可见到类似于人肝细胞的“嗜酸性变”或“嗜酸性小体”之改变。A组的个别动物(后来发生HCC)的早期肝活检组织中可见HBsAg阳性的类似于人肝“毛玻璃样肝细胞”的改变。

　　3　讨论

　　以上结果显示，接受HBV及AFB1双因素的A组不仅HCC的发生率较仅接受AFB1单因素的C组高，并且HCC的平均发生时间也显著短于C组，从而再次证实了HBV与AFB1在树鼩HCC形成中的协同作用。本实验仅接受HBV单因素的B组，虽至实验结束时尚无一例HCC发生，但动态观察中发现该组的肝细胞增生灶/结节发生较早、较多，并且一例中途死亡的动物肝脏已出现直径大于0.5cm的增生结节，提示HBV具有诱发肿瘤生长的能力，虽其单独作为诱癌因素时作用较弱。这些结果不仅与本实验室过去报道的研究结果^[2]相一致，而且与人类HCC的有关研究结果也吻合。Lunn等^[3]最近对台湾的百余例人HCC进行研究，发现在人肝组织中AFB1-DNA加成物和血清中HBsAg这两个标志发生HCC的相对危险性，以两个标志均阳性最高，AFB1-DNA加成物阳性次之，HBsAg单独阳性发生HCC的危险性相对最低。他们因此认为在HCC形成机制中存在着病毒－化学相互作用(viral-chemical interaction)。

　　本研究中见到的颇具特征的“透明细胞灶”，也见于Bannasch等关于土拨鼠肝炎病毒(WHV)与AFB1协同致肝癌作用的研究，他们认为这是一种较早期的肝癌前病变；由于这种灶以及后来出现的嗜酸/碱性结节可见于不同处理的各实验组，提示肝炎病毒与AFB1在诱癌机制上可能存在着相似性，而此相似性可能正是二者协同作用的基础^[4]。

　　人类HCC的发生率存在着明显的性别差异，迄今对此现象尚无一明确的解释。本研究结果显示A、C组HCC的发生率均为雌性树鼩高于雄性，推测这可能是由于雌性鼩对AFB1的敏感性高于雄性。我们过去的短期实验结果曾提示这种可能^[5]。Reddy等报道的结果也支持这一推测：他们用AFB1加入饲料中喂予树鼩，经过172周，HCC在雄、雌性树鼩的发生率分别为3/6(50％)及6/6(100％)^[6]。树鼩这种与大鼠等动物截然不同的对化学致肝癌物的敏感性的性别差异，尚待进一步研究证实。另一方面，Dragani等用HBsAg转基因小鼠作化学诱癌实验发现雄性的HBV(＋)小鼠经DAB或DEN等化学致肝癌物处理后，肝细胞增生结节及肿瘤的发生率高于HBV(－)组；但雌性的HBV(＋)及HBV(－)组间上述病变的发生率无明显差别^[7]。而本实验A组与C组相比，HCC发生率及平均发生时间的提高幅度在雄、雌性间差别不大。这是否因所用的实验动物特性不同或实验方法不同，有待于探讨。

　　本研究的A、B、C各实验组动物肝脏均见到类似人类肝脏的炎症、变性、增生等改变，A组的个别动物甚至出现HBsAg阳性的“毛玻璃样”肝细胞，提示本研究所用的树鼩模型不失为一个研究人类HCC发生和发展、病因和机制的较好动物实验模型。

　　至于HBV如何与AFB1在HCC的形成中起作用，目前所知不多。比较传统的观点认为HBV在HCC形成中的作用与其感染后引起的肝细胞损伤、坏死及再生有关。本研究通过对HCC形成前各次肝活检组织的观察，发现相应动物在HCC形成前肝细胞的点灶性坏死、炎细胞浸润以及肝细胞的增生性病变较为活跃，支持这一观点。Jakubczak等近用TGF-α(转化生长因子-α)及HBsAg双基因转化的小鼠作研究，发现肝细胞增生率、HCC形成率及速度明显增高^[8]，也支持HBV可能通过诱导肝细胞增生来与AFB1协同致肝癌的观点。但Petersen等最近报道，他们将土拨鼠的肝细胞接种于一种无T、B淋巴细胞的小鼠后，再用土拨鼠肝炎病毒(WHV)感染小鼠，结果发现WHV可在这些小鼠的土拨鼠肝细胞内造成持续性的无淋巴细胞毒性反应的感染并导致HCC形成^[9]。此结果对传统的“HBV感染→宿主肝细胞免疫反应→肝炎→肝癌”观点提出了挑战。HBV感染导致肝细胞损伤后，也有可能是通过使肝内某些AFB1的代谢酶类(如细胞色素p450的某些亚型)发生改变来协同AFB1致癌的^[10]。此外，抑癌基因p53在HCC形成中的作用近年来也有较多的研究，Ghebranious等近用转基因小鼠作研究，发现用p53等位因基缺失、HBV及AFB1三因素共同处理的动物，雄性100％(7/7)发生HCC；而上述三因素无论缺哪个时，HCC发生率均降低，提示p53基因的改变可能在HBV和AFB1的协同致肝癌过程中起作用^[11]。

　　本文所报道的只是本项实验研究的部分结果。有关癌基因、抑癌基因的动态观察结果将另行报道。

　　(致谢：本研究得到本室罗丹副主任医师、罗小玲主治医师、黄国华技师和欧超技士的帮助，特此致谢。)

　　基金项目：国家自然科学基金项目(39260033)；广东省科学基金项目(940222)和广西留学回国人员科学基金项目(96－32006)资助

　　作者单位：李瑗　苏建家　覃柳亮　杨春　班克臣　广西肿瘤研究所病理研究室(南宁，530027)

　　严瑞琪　王辉云　中山医科大学肿瘤研究所病理研究室(广州，510060)

　　参考文献

　　1　Montesano R, Hainaut P, Wild CP. Hepatocellular carinoma: form gene to public health〔J〕. J Natl Cancer Inst, 1997, 89(24):1844.

　　2　严瑞琪，苏建家，黄定瑞，等.人乙型肝炎病毒和黄曲霉B1诱发树鼠句原发性肝癌的研究〔J〕.中华病理学杂志，1989，18(1)：19.

　　3　Lunn RM, Zhang YJ, Wang LY, et al. p53 mutations, chronic hepatitis B virus infection, and aflatoxin exposure in hepatocellular carcinoma in Taiwa〔J〕. Cancer Res, 1997, 57(16):3471.

　　4　Bannasch P, Khoshkhou NI, Hacker HJ, et al. Synergistic hepatocarcinogenic effect of hepadnaviral infection and dietary aflatoxine B1 in woodchucks〔J〕. Cancer Res, 1995, 55:3318.

　　5　李瑗，苏建家，覃柳亮，等.OLT对AFB1的化学预防作用在树鼠句的实验研究〔J〕.癌症，1999，18(1)：34.

　　6　Reddy JK ,Svoboda DJ and Rao MS. Induction of liver tumors by aflatoxin B1 in the tree shrew (Tupaia glis), a nonhuman primate〔J〕. Cancer Res, 1976, 36:151.

　　7　Dragani TA, Manenti G, Farza H, et al. Transgenic mice containing hepatitis B virus sequences are more susceptible to carcinogen-induced hepatocarcinogenesis〔J〕. Carcinogenesis, 1990, 11(6):953.

　　8　Jakubczak JL, Chisari FV and Merlino G. Synergy between transforming growth factor α and hepatitis B virus surface antigen in hepatocellular proliferation and carcinogenesis〔J〕. Cancer Res, 1997, 57(16):3606.

　　9　Petersen J, Dandri M, Gupta S, et al. Liver repopulation with xenogenic hepatocytes in B and T cell-deficient mice leads to chronic hepadnavirus infection and clonal growth of hepatocellular carcinoma〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(1):310.

　　10　Kirby GM, Chemin I, Montesano R, et al. Induction of specific cytochrome P450s involved in aflatoxin B1 metabolism in hepatitis B virus transgenic mice〔J〕. Mol Carcinog, 1994, 11(2):74.

　　11　Ghebranious N and Sell S. Hepatitis B injury, male gender , aflatoxin, and p53 expression each contribute to hepatocarcinogenesis in transgenic mice〔J〕. Hepatology, 1998, 27(2):383.