转人肝刺激物质基因的肝癌细胞增殖状态研究
生理学报 2001年第6期第53卷
首都医科大学细胞生物系；100054 北京 安威*；杜海军；陈莉
关键词：肝刺激物质；基因转染；肝癌细胞增殖
摘要：本文通过研究转染人肝刺激物质(hepatic stimulator substance, HSS)的肝癌细胞增殖状态,进一步探讨了该基因的生物学功能。将人HSS基因导入BEL7402肝癌细胞, 用Northern和Southern杂交法证实该基因在靶细胞中有稳定表达。并通过测定细胞生长曲线、细胞S期比例和细胞MAPK活性, 观察到转HSS基因BEL7402细胞增殖发生了改变。实验结果提示, hSS表达的肝癌细胞DNA合成增加、 增殖速度加快, 可能与MAPK激活有关。HSS基因表达可促进细胞增殖。肝再生受多因素调节［1］, 其中生长因子对肝再生的调节尤为重要。1975年LaBrecque报道,由初断乳或部分肝切除的大鼠肝中提取的一种活性物质可刺激肝细胞增殖, 这种物质被命名为肝再生刺激物质(hepatic regenerative stimulatory substance, HRSS)［2］, 后简称之肝刺激物质(hepatic stimulator substance, HSS)。继而研究证实, hSS是一种分子量约为15 kD的蛋白质, 抗酸、 耐碱, 能特异性促进肝细胞或肝源性肿瘤细胞系DNA合成［3］。就整体动物而言, HSS可减轻肝细胞内超微结构的受损程度,促进细胞再生［4］, 但是HSS对离体肝细胞的作用结果尚存一些争议［5］。临床研究表明［6］, 人胎肝制剂治疗重症肝炎有一定疗效, 推测该制剂中含HSS样的活性物质。然而涉及人HSS生物学活性、作用于肝细胞的部位、基因表达调节等分子生物学方面, 迄今尚无完整的报道。最近, 我们利用鼠HSS基因探针, 克隆出人HSS基因并建立起转染HSS基因的BEL7402肝细胞。本课题观察了转基因细胞的增殖状态,探讨HSS基因的功能和HSS基因调节的机制, 以求对HSS的本质有全面的了解。
1材料和方法
1.1 人HSS基因克隆和重组载体的构建由发育正常23周水囊引产胎儿肝组织提取总RNA［7］。以鼠ALR两端引物(5′CGG AAT TCC ATA TGC gGA CCC AGC AGA AGC G3′和5′GCA GTC GAC TTA GTC ACA GGA GCC3′)与RNA进行RTPCR,以扩增人HSS。PCR产物经琼脂糖电泳, 获得约400 bp片段, 纯化后克隆至pUC18质粒EcoR I和Sal I位点。随机挑选15个pUC18阳性克隆,制备质粒DNA, 以M13正反双向通用引物测序。测序结果采用DNAstar 软件加以分析, 据此推论人HSS基因的开放读框 (open reading frame, ORF)。将HSS之ORF序列两端以EcoR I和Xho I修饰, 然后插入pcDNA3.1质粒(Invitrogen公司)的相应位点。重组质粒用DOTAP(Boehringer mannheim公司)导入BEL7402肝癌细胞, 经G418筛选, 得到抗药性细胞克隆团,再扩大培养。另设转pCDNA3.1质粒细胞作为对照。待细胞长至汇合时, 提取细胞RNA, 鉴定HSS表达。
1.2 Northern和Southern 杂交［8］分别提取转染HSS基因细胞和对照细胞的RNA。取20 μg RNA, 甲醛/甲酰胺变性,1%琼脂糖凝胶电泳分离, 转印至尼龙膜。该膜与［α32P］dCTP(Amersham公司)标记的人HSS探针杂交16 h。经充分漂洗,进行杂交膜放射自显影。Northern杂交以甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, gAPDH)作为内参。为保证Northern 杂交的特异性, 实验同时应用RTPCR和Southern杂交, 对HSS表达再加以确认。其简要步骤为:取上述各组细胞2 μg RNA为模板, 以人HSS 基因ORF区引物进行RTPCR, 条件为94℃ 50 s、 65℃ 40 s、 72℃ 40 s,扩增25循环。在整个反应体系中, 以βactin同步扩增作为PCR内参。将PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 以碱变性处理,再印渍到尼龙膜上。该膜经紫外交联, 按上述条件进行Southern杂交、 漂洗和曝光。
1.3 细胞增殖测定将对照及HSS转染细胞(1×106细胞)分别接种于25 cm2 培养皿, 以含胰岛素(10 μg/ml)的无血清DMEM培养24 h,使其同步化。先以磷酸缓冲液(PBS, pH 7.4)洗涤三次, 用0.25%胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液并按5×103/孔细胞密度分种于96孔板,再于CO2孵箱(95%空气5% CO2) 37℃培养20 h。以噻唑蓝法［9］［3(4,5di~meth~yl~thiazol2yl)2,5di~phen~yl~te~trazo~lium bromide, MTT］于490 nm处测定24～144 h之间两组细胞吸光值变化, 每时间点取6孔细胞测定。设时间为横坐标, 吸光值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。同样, 另取两组1×106细胞, 用冰冷70%乙醇过夜固定。次日以PBS洗涤, 经过100 μl RNase (10 mg/ml)消化及碘化丙啶(PI)染色, 立即在FCAS440流式细胞仪上测定细胞周期。
1.4 Western 杂交分别提取上述两组细胞总蛋白, 用BCA方法［10］测定蛋白含量。取50 μg蛋白, 进行12% SDSPAGE分离。尔后,将胶中蛋白以半干法转印至硝酸纤维素膜上。该膜经5%脱脂奶粉4℃过夜封闭, 次日再与抗磷酸化MAPK多克隆抗体(Thr202/Tyr204)及与辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG抗体(均购于SantaCruz公司)先后各孵育1 h。采用增强化学发光法检测Western杂交信号强度。曝光于X光片信号的密度值经GS700扫描仪进行半定量分析。
2结果
2.1 转染细胞外源基因的表达
各组细胞HSS RNA 表达的结果如图1所示。转染细胞RNA与HSS探针杂交后呈现一清晰条带, 位置在1.35 kb处, 其分子量大小与胎肝组织和HepG2细胞HSS杂交结果相同(本室未发表资料),提示转染HSS基因在BEL7402细胞得以表达。GAPDH内标准检测结果显示, 各条泳道RNA加样量一致。此外, RTPCR扩增结果显示, 转染HSS细胞PCR产物的生成较对照细胞明显增多,经Southern 杂交后呈现出极强的放射信号。而应用内标准常规25循环同步扩增证明, 各组间βactin产量一致, 再次说明转染HSS基因在BEL7402靶细胞中表达成功。
2.2 细胞增殖
通过MTT法测得细胞生长曲线, 如表1所示。可以看出, 转染细胞生长速度高于对照细胞,对其吸光值作统计学分析P＜0.01,两者之间存在非常显著性差异。细胞周期分析结果, 如该图所示, 随机测定1×106细胞, 转染细胞S期所占细胞比例为26.05%,而对照细胞S期仅为16.13%, 两者比较相差61.5%, P＜0.01。此外, 转染细胞M期与G2期细胞百分比之和高出对照44%, 进一步说明转人HSS基因可促进肝癌细胞DNA合成。
2.3 细胞MAPK磷酸化水平
mAPK磷酸化是细胞信号传递入核前的重要标志［11］。可以看出两组细胞的非磷酸化MAPK含量基本一致,表现为p42MAPK和p44MAPK两条均一带型。虽为肿瘤细胞系, 野生型BEL7402细胞MAPK磷酸化基础水平较低。转染HSS基因后, MAPK磷酸化显著增强,扫描数据表明, 转HSS基因细胞磷酸化MAPK的密度值较对照细胞升高60.4%。虽然单纯转pCDNA3.1质粒本身可上调MAPK的活性, 但效果较弱,故推测转染细胞MAPK磷酸化增强可能为转HSS基因所引发。
3讨论
早在30年代初, 人们就发现动物胎肝中有一种生物活性物质能促进肝再生［12］。然而迟至80年代后期, laBrecque［13］及Fleig［14］等才相继证明这种物质的存在并加以部分纯化, 命名肝刺激因子(HSS)。迄今, 人们对HSS促进动物肝再生的作用已一致认同［15,16］,但对刺激离体肝细胞的增殖尚存疑义。 其原因在于, 早期报道HSS在体外不能独立诱导肝细胞再生, 但可增强其它生长因子作用, 故有人将HSS谓之肝再生增强子(augmenter of liver regeneration, ALR)［5］。研究发现, HSS刺激动物肝再生与免疫系统有关。肝部分切除致使肝脏贮存的(liverresident)天然杀伤细胞(natural killer, NK) 迅速活化, 阻止肝细胞增殖。而HSS特异性抑制NK细胞的活性, 因此刺激肝再生［17］。由于肝细胞原代培养体系中不含NK细胞,因而HSS在体外不能启动离体细胞增殖。晚近有报道称, 基因重组ALR可诱导体外培养的肝肿瘤细胞增殖［18］, 这一结果似乎有驳上述观点。由此看来,对该物质的基因本质与功能还需进一步深入研究。
从HepG2肝细胞已克隆出ALR基因［19］。本文所测定的人HSS序列除两处碱基与ALR不同外, 最主要的差别在于74位胞嘧啶(C)缺失。如果74位C的确存在,会造成整个ALR开放读框系统的移码突变, 对于这一问题作者未做任何解释。我们对人HSS 15个基因克隆进行反复测序, 结果一致, 因此尚难认定HSS与ALR是否同源［20］,且该问题也并非本文立意所在。Northern杂交发现, HepG2与另一种肝肿瘤细胞Huh7中的HSS mRNA表达极高(另文报道), 鉴于野生型BEL7402细胞HSS表达较低(图1A,泳道3), 因此可作为转染HSS基因的理想靶细胞, 选用该细胞有利于排除内源性HSS对实验产生的干扰因素。
杨晓明等报道, 从ALR转染COS7细胞制备的胞浆提取液, 可刺激体外培养的肝肿瘤细胞DNA合成［18］。由于实验未给出重组ALR的表达效率及提取液中ALR蛋白含量,因此有关重组ALR刺激细胞增殖的活性值得商榷。而本实验建立了HSS基因表达的肝癌细胞, 并证实转染HSS基因能刺激MAPK活化, 促进靶细胞增殖,从而在分子生物学水平进一步明确了该基因的功能, 为我们前期有关HSS促进体外肝细胞增殖的系列实验［4, 21～23］结论提供了又一重要佐证。应当指出,虽然本文得出的转染HSS基因可促进肝癌细胞生长, 但外源基因在靶细胞中的表达不仅受载体特点、 DNA转染方式以及外源基因整合位点等影响,更主要是受靶细胞自身基因组顺式结构(ciselements)的调节。如是, 明确HSS基因组结构及相应的转录调控特点则是我们下一个工作目标。
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