钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流

　　福建医科大学学报1999年第33卷第3期

陈景龙

　　 目的：通过钙调蛋白抑制剂来研究钙调蛋白在Reuber肝癌细胞池操纵钙内流的作用及其机制。 方法：以Reuber肝癌细胞系为材料，用钙离子回加技术、荧光显微镜技术以及加与不加钙调蛋白抑制剂来检测、定量该细胞系的钙释放、钙内流及钙内流速率。 结果：钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞池操纵的钙内流。钙调蛋白抑制剂W13、W7、calmidazolium无论加在毒胡萝卜素(Tg)之前或之后，均能抑制由Tg引起的细胞钙内流。 结论：钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流。其机制可能是钙调蛋白参与肌醇三磷酸协调的Ca²⁺从内质网的释放或直接与膜上钙离子通道的通道蛋白接合而起作用的。

　　关键词：钙调蛋白　Reuber肝癌细胞(H4-ⅡE)　池操纵的钙内流

　　肝细胞是一类极化的上皮细胞，它在调节细胞各种生理机能上起到了极为重要的作用，包括新陈代谢、能量转化、合成、分泌蛋白质及胆汁酸等等。这些过程的进行和完成均受到激素的调控。激素在调节细胞生理功能的过程中，许多都以升高细胞质内游离钙离子浓度Ca²⁺］_C作为细胞间的信号^［1］。而细胞内游离钙离子浓度的改变也是一种动物细胞把信息从细胞外传到细胞内相关位点的主要方式。同时，Ca²⁺］_C的变化强度、位置、持续的时间均代表细胞内钙离子的信号传递过程。而细胞内一定区域钙离子浓度的升高通常是由细胞外的信号分子(拮抗剂)结合到细胞膜的受体上从而引起信号传递的。在肝细胞中，Ca²⁺］_C的升高可由钙离子从细胞外通过细胞膜进入胞质，或者可由Ca²⁺］从内质网中释放到细胞质中。对于细胞外钙离子的跨膜进入，可通过电压操纵的Ca²⁺通道(voltage-operated Ca²⁺ channels,VOCCs)，配体门控的非特异性离子通道(ligand-gated non-specific cation channels,LGCCs)和受体激活的Ca²⁺通道　　(receptor-activated Ca²⁺ channels,RACCs)^［2,3］。由于RACCs分型多，每一种细胞又包含有许多种的RACCs，且每一种RACCs的生理功能、电生理特性、结构和激活机制上又都各自不同，因此，RACCs到目前还了解不清楚^［4］。池操纵的Ca²⁺通道(store-operated Ca²⁺channels,SOCs)是至今研究最多、最热门、也最受重视的一个RACCs亚群。这种钙离子通道位于细胞膜上，该通道的打开是受内质网腔内的Ca²⁺浓度［Ca²⁺］er降低而引起的。在细胞的生理条件下，Ca²⁺］er的降低，可以导致肌醇三磷酸与肌醇三磷酸受体［Ca²⁺］通道结合，从而启动细胞膜上钙离子通道的打开。而这些钙离子通道的打开以及内质网膜上肌醇三磷酸受体与肌醇三磷酸的结合，均与钙调蛋白的作用有一定的关系^［5］。因此，本文通过检测由毒胡萝卜素刺激引起的H4-ⅡE细胞钙释放及内流来研究钙调蛋白在其中的作用，以及试图对H4-ⅡE细胞膜上的钙离子通道的结构及属性进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　毒胡萝卜素(毒胡萝卜素，Tg)，calmidazolium,W7［N-6(-amino-hexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulphonamide］,W13［N-(4-aminobutyl)-5-chloro-2-naphthalenesulpho\|

　　namide］，离子霉素(ionomycin)，以上药品购自Sigma公司。其余常用化学药品与试剂来源同文献^［6］。fluo-3 acetoxymethylester(fluo-3/AM)购自美国Molecular Probes公司。

　　1.2 细胞培养

　　H4-ⅡE细胞系(一种来源于Reuber大鼠肝癌细胞的永久细胞系，ATCC CRL 1548)在37℃　5％(v/v)CO₂浓度于完全DMEM培养基(complete DMEM,cDMEM)置于CO₂培养箱中培养。cDMEM含有100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，10 mmol肝素,pH 7.4，10％(v/v)小牛血清。因为该细胞系为贴壁生长的细胞，转种时用胰蛋白酶(0.1％w/v)和EDTA(0.2％w/v)进行洗脱细胞。

　　1.3 细胞内游离钙离子浓度、钙池内钙离子释放、钙内流速率的检测

　　实验时，选择不超过转种15代的H4-ⅡE\生长状态良好的细胞进行钙浓度的测定。(1)把细胞接种在有胶原蛋白包被的无菌圆玻片上(直径22 mm，每片约0.6×10⁶个细胞)，置于37℃ 5％(v/v)CO₂培养箱中培养使细胞在圆玻片上贴壁生长成铺满玻片的单层细胞后，进行细胞荧光染色。(2)细胞荧光染色时，把含有单层细胞的圆玻片置于含有40 μmol/L fluo-3/AM，0.05％(v/v)Pluronic F-127酸的cDMEM培养基中37℃5％CO₂条件下培养约0.5 h。(3)染色后，细胞用改良的Krebs-Henseleit缓冲液mmol/L:NaCl 117,KCl 4.7，MgSO₄ 1.2，NaHCO₃ 24，TES 20，用KOH调整pH值至7.4),在室温下漂洗3次。(4)把含有单层细胞的圆玻片置于倒置的Nikon TMD-EF荧光显微镜下进行荧光检测与实验。在检测时，用40倍油镜头，细胞孵育室温度控制在34℃，用P1型光度仪(Nikon)，UMANS滤片转换器及电脑软件或者滤片轮(Sutter)，高密度CCD镜头(ISIS-3/S20，Photonic Science)和Axon成像工作平台(2.1版本)进行荧光测量。按公式算出细胞内游离钙离子浓度。Ca²⁺］_C=(F-Fmin)/(Fmax-F)×400 nmol^［7］。式中，F代表某一时刻的荧光强度，Fmin，Fmax分别代表细胞最小、最大荧光强度。对结果进行统计学处理。

　　细胞在检测钙离子浓度时，开始先置于无［Ca²⁺］的Krebs-Henseleit缓冲液中，测出细胞的基础荧光强度，然后，再用10 μmol/L Tg加入缓冲液，使细胞内钙离子从钙池中释放到细胞质中，加入Tg后与不加Tg前荧光强度值之差即表示释放出的Ca²⁺(图1)。待钙池中的钙离子释放之后，在细胞外加入过量的CaCl₂(5 mmol/L)，进行钙内流及钙初始内流速率的检测(加钙离子的时间及长度如图1所示)。最后用10 μmol/L离子霉素 和20 mmol/L的乙二醇双（乙-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）溶于Tris碱（pH 8.8)校准实验得出最大、最小荧光强度。钙调蛋白抑制剂(W13，W7，calmidazolium)对Tg刺激的\{H4-ⅡE\}细胞钙离子浓度的变化和影响（如图1），指示出钙调蛋白抑制剂使用及维持的时间。

图1 W13抑制H4-ⅡE细胞中毒胡萝卜素（Tg）诱导的钙内流

　　a:W13加在Tg前；　B:W13加在Tg后；　箭头示加入钙离子或Tg；　图上方空心线条示加入W13.

　　2 结 果

　　H4-ⅡE细胞在用毒胡萝卜素（Tg）刺激之后，细胞的荧光强度产生一个峰值,代表细胞质内游离Ca²⁺浓度的升高(图1中上面的一条曲线)。由于此时在细胞外的缓冲液中并无Ca²⁺，因此，此时Ca²⁺浓度的升高，是由于细胞内质网内的钙池内的Ca²⁺释放到细胞质中。当在细胞外继续加入过量的Ca²⁺时，细胞外的Ca²⁺就通过细胞膜上的钙通道大量进入细胞质内，从而出现细胞荧光强度快速产生另一个峰值(图1中上面的一条曲线)。由Tg刺激引起的H4-ⅡE细胞的钙释放、钙内流及其初始钙内流率见附表。

附表 钙调蛋白抑制剂毒胡萝卜素诱导的Ca²⁺从钙池释放及钙内流（x±s）

　　 统计学处理的差异程度由加与不加抑制剂组进行不均衡t检验，*：P＜0.001.　　当在Tg刺激H4-ⅡE细胞之前加入钙调蛋白抑制剂W13时，W13能明显抑制由Tg激起的Ca²⁺从钙池中的释放(图1A中下面的一条曲线)。它的半数最大抑制浓度(IC₅₀)约为54 μmol/L。不论W13在Tg刺激细胞前或后加入，从图1A及图1B中，都可以发现W13均能抑制由Tg产生的Ca²⁺内流及其初始速率(图1中下面的一条曲线)。在Tg之前及之后引起钙内流抑制，其IC₅₀分别为约44和63 μmol/L。在Tg之前及之后，不同浓度的W13对Tg激起的H4-ⅡE细胞钙释放、钙内流及内流速率的影响和抑制情况，如图2所示。

图2 W13抑制浓度曲线图

　　a:W13抑制毒胡萝卜素（Tg）诱导的钙离子从钙池释放； B，C:W13加在Tg前或后的钙内流。图中数据由3～7个单独的实验所得（均数±标准差），实心曲线由目测绘出。

　　W7、calmidazolium与W13一样，同样也能抑制由Tg刺激引起的钙释放和钙内流。W7是W13的类似物。因此，其抑制情况与作用效果与W13相似(附表)。不论在Tg之前或之后加入，它们的抑制效果都是随浓度的升高而增强。只是当W7在Tg之前加入似乎比在Tg之后加入更能抑制由Tg诱导的钙内流(表1)。W7在Tg之后加入，IC₅₀为80 μmol/L。Calmidazolium同W13，W7相比，其抑制效果更强。它的IC₅₀(在Tg之前加入时)仅约为5.2 μmol。与不加calmidazolium的空白对照组相比，calmidazolium不论在Tg之前还是之后加入，均能明显抑制H4-ⅡE细胞的钙内流(P＜0.001，附表)，且亦能抑制钙离子从钙池的释放。不同浓度的calmidazolium对Tg诱导的H4-ⅡE细胞钙离子的释放作用以及在Tg之后加入时，对细胞钙内流的抑制，并不随着浓度的升高而升高(附表)。这种情况同Cao和Chatton在大鼠肝细胞中的实验所得的结果有些相似^［5］。

　　3 讨 论

　　3．1 钙调蛋白及其抑制剂的作用机制

　　毒胡萝卜素（Tg）是一种细胞肌浆网或内质网的钙镁离子ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum(Ca²⁺+Mg²⁺)ATPase，SERCA)的抑制剂，当Tg加入无外源性Ca²⁺的H4-ⅡE细胞时，由于SERCA受抑制，钙池里的Ca²⁺浓度降低，细胞质中的Ca²⁺浓度升高，从而通过一定的机制诱导细胞膜上的RACCs进入细胞质内。由于W13，W7，calmidazolium均能抑制钙调蛋白依赖的磷酸二酯酶(calmodulin-dependent phosphodiesterase)，加入这些药物到细胞中，钙调蛋白的作用就会被抑制。本实验的结果说明了钙调蛋白参与了由Tg激发引起的H4-ⅡE膜上RACCs的打开。钙调蛋白最有可能参与的两个地方是：(1)参与肌醇三磷酸(InsP3)协调的Ca²⁺从钙池的释放；(2)钙调蛋白与Ca²⁺结合后直接与细胞膜上的钙通道蛋白作用从而调节膜上钙通道的打开。由于钙调蛋白的功能受到拮抗剂的抑制，同时也影响了依赖钙调蛋白与钙调蛋白结合的许多酶类^［8,9］，比如维持细胞骨架完整的一些酶类。因此，当高浓度的calmidazolium(大于5 μmol/L)、W13和W7(均高于100 μmol/L)加入到H4-ⅡE细胞中时，维持细胞骨架的酶类因为钙调蛋白的抑制而受影响，从而出现了细胞形态的改变。象细胞变圆，细胞易于从胶原蛋白包被的圆玻片上剥落，细胞表面出现泡状突起，甚而出现细胞破裂。

　　3．2 H4-ⅡE细胞池操纵钙通道的属性

　　已有研究证实，在大鼠的肝细胞中，钙调蛋白至少参与了由SOCs被激活而引起的Ca²⁺通道的打开^［5］。为了进一步研究钙调蛋白在H4-ⅡE细胞中的作用以及该细胞上RACCs的属性。笔者检测了用EGTA预处理的H4-ⅡE细胞的Ca²⁺内流情况，由于Tg刺激，使H4-ⅡE细胞在内质网钙池内钙离子降低(释放)时，同时也导致了［Ca²⁺］_C的升高。而用EGTA预处理后，只是细胞内钙池中Ca²⁺的降低，而并没有引起帮助［Ca²⁺］_C的升高。根据EGTA预处理激起的Ca²⁺内流结果分析，发现其内流情况与Tg激起的钙内流很相似，而且EGTA预处理引起的H4-ⅡE细胞钙内流还可以被SK&F96365、Gd³⁺所抑制，Tg激起的该细胞钙内流也能完全被Gd³⁺(SOCs的一个特性)^［10］所抑制(结果另文发表)。由此说明Tg诱导的H4-ⅡE细胞钙内流是通过RACCs中的SOCs(比如通过内质网上钙池内Ca²⁺的降低而诱导，而非由于细胞质内［Ca²⁺］_C的升高而引起，后者往往可以激发由Ca²⁺诱导的非选择性离子通道^［4］，Ca²⁺-activated non-selective cation channels)。

　　另外，H4-ⅡE细胞的SOCs与大鼠肝细胞的SOCs属性不同，大鼠肝细胞SOCs的打开与激活，要有G蛋白的参与。G蛋白被认为是在调节肌动蛋白细胞骨架，维持内质网在细胞中正确的空间位置，以及内质网腔间的通信扮演重要的角色。而H4-ⅡE细胞经百日咳毒素(pertussis toxin)或brefeldin A(抑制三体G蛋白作用)处理后，Tg诱导的H4-ⅡE细胞的钙内流并不受明显抑制。因此，没有证据说明G蛋白参与了H4-ⅡE上的SOCs的打开与激活。但是，H4-ⅡE细胞膜上SOCs许多其他属性以及其他类型的RACCs,以及该细胞膜上其他类型的钙通道，比如VOCCs、LGCCs等许多问题有待解决和证实。近几年来，从果蝇(Drosophila)光受体细胞上克隆下来的transient receptor potential(TRP)和Trp-like(Trpl)基因，被认为是研究动物细胞RACCs的最佳选择^［11］。因而，H4-ⅡE细胞作为永久细胞系，无疑在研究细胞RACCs，SOCs上有许多优点，如把Trp、Trpl或他们的同系物转导(transfection)到H4-ⅡE细胞中，或在该细胞中转入反义DNA，观察H4-ⅡE细胞钙通道属性的变化，将为进一步了解该细胞膜上有关钙离子通道的结构和机制提供新的结果和证据。

　　（致谢：本研究由国家留学基金委及澳大利亚Flinders大学共同资助下完成，作者在澳洲做访问学者期间受到医学生化系主任Gregory J. Barritt教授悉心指导，在此深表谢意。并感谢该系其他同仁所给予的一切支持和帮助。）

　　作者单位：福建医科大学寄生虫学教研室(福州 350004)

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