preS2反义寡核苷酸降低端粒酶活性及诱导肝癌细胞凋亡的作用

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 病毒学

作者：马春红　孙汶生　张利宁　曹英林　宋静　丁培芳

单位：250012 济南，山东医科大学微生物与免疫学教研室

　　反义核酸技术从分子水平破坏靶基因，已用于多种抗病毒的试验。我们以人工合成的硫代反义寡核苷酸研究针对HBV不同区段反义寡核苷酸HBV的抑制作用，从中筛选了效果最好的针对HBV preS2的反义序列(as-preS2)。为进一步探讨as-preS2在肝癌治疗中的应用价值，以HBV DNA整合的肝母细胞瘤细胞HepG2.2.15为研究对象，采用FACSCAN流式仪检测细胞凋亡率，TRAP银染测定细胞端粒酶活性，同时以RIA法检测培养上清中的血清铁蛋白浓度。

　　设计合成针对pre-S2基因(per-S2)翻译起始区(3203～3219)的反义寡核苷酸(as-preS2):5′CCA CTG CAT GGC CTA AG 3′，同时设置HBV非互补随机对照(Random): 5′ATC ACG AGG GGC TGT 3′。HepG2.2.15细胞以1×10⁵/ml接种96孔板，每孔100μl，第2天贴壁后加入终浓度10μmol/L的as-preS2/Random，3孔重复，同时设细胞对照组(加入100μl MEM培养基)，作用一定时间后，细胞以0.25%胰酶消化，PBS悬浮细胞，4℃保存，待测。取as-preS2作用3d、6d的PBS悬浮细胞5×10⁵～1×10⁶，70%冷乙醇固定，Propidium iodide染色，流式细胞仪(FACSCAN)测定凋亡率；取asON作用3d的PBS悬浮细胞(1～5)×10⁵，以TRAP银染法测定端粒酶活性；HepG2.2.15细胞经as-preS2作用2d后，收集上清，RIA法测定培养上清中血清铁蛋白浓度，共反复6次，结果取均值。

　　结果表明：用药后第3天，实验组和对照组凋亡率分别为6.13%和1.16%，实验组显著高于对照组(P＜0.05),且端粒酶活性显著降低；用药后第6天，实验组凋亡率仍显著高于对照组(6.43% vs 1.77%,P＜0.05)。as-preS2作用2d后，用药组与未用药组培养上清中血清铁蛋白浓度分别为28.16和28.13，无显著性变化(P＞0.05)，提示as-preS2对宿主细胞自身蛋白分泌无影响。

　　HBV相关肝细胞肝癌(HCC)中HBV病毒基因整合及端粒酶的强阳性均已有证实，若能同时抑制上述因素，将极有希望成为治疗HBV相关HCC的有效手段。RIA结果证明as-preS2并不影响宿主细胞自身蛋白的分泌，对细胞没有毒性，有可能成为新一代肝癌治疗药物。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970333)

(收稿日期：2000-03-27)