长春花碱和细胞松驰素D对肝癌细胞粘弹性的影响

中国生物医学工程学报 2000年第2期第19卷 生物医用材料

作者：张钢　吴泽志　王红兵　龙勉　宋关斌　蔡绍皙

单位：张钢（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）；吴泽志（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）；王红兵（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）；龙勉（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）；宋关斌（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）；蔡绍皙（重庆大学生物工程研究院，国家教委生物力学开放实验室，重庆 400044）

关键词：肝实质细胞癌；肝细胞；粘弹性；长春花碱；细胞松驰素D

　　用微管吸吮技术测定了正常肝细胞和肝实质细胞癌细胞的粘弹性，以三参数标准线性固体模型拟合实验结果，进一步研究了两种细胞骨架干扰剂处理后肝细胞和肝癌细胞粘弹性系数的变化。结果表明，肝癌细胞的弹性系数较肝细胞的相应值增高，药物作用后肝癌细胞粘弹性系数较对照组均有显著性下降，而正常肝细胞在长春花碱作用后，其弹性系数较对照组有显著性上升，在细胞松驰素D作用下肝细胞粘弹性系数呈现与肝癌细胞相似的下降趋势，作者对这一结果进行了简要的讨论。

　　分类号： 　R318.01; R333.4

EFFECT OF VINBLASTINE AND CYTOCHALASIN D

　　OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA CELLS

Zhang Gang, Wu Zezhi, Wang Hongbing, Long Mian, Song Guanbing, Cai Shaoxi

　　(Bioengineering Research Institute, Chongqing University, Chongqing 630044)

ABSTRACT

　　Using micropipette aspiration technique, the authors investigated the viscoelastic properties of human hepatocytes and hepatocellular carcinoma (HCC) cells, and the experimental results were fitted with a three-element standard linear solid model. Further, the authors investigated the change in viscoelastic properties of both hepatocytes and HCC cells by treatments with two drugs.

　　Results showed: The elastic coefficients of HCC cells were obviously higher than the corresponding values of hepatocytes. After treatment with vinblastine and cytochalasin D, the viscoelastic coefficients of HCC cells were significantly lower than those of control. Under the action of vinblastine, the elastic coefficients of hepatocytes increased obviously than those of control, but the viscoelastic properties of hepatocytes treated with cytochalasin D had the same trend of decreasing as that of HCC cells. A breaf discussion was presented about these results.

　　Key words:　Hepatocellular carcinoma; Hepatocytes; Viscoelasticity; Vinblastine; Cytochalasin D

　　0　引言

　　肝实质细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC，简称肝癌)的生长，浸润与转移是一个存在复杂的细胞流变学机制的病理过程，其浸润性生长和穿透内皮细胞是以癌细胞运动和变形为基础的过程，细胞粘弹性是与细胞运动和变形有关的重要生物物理特性，对肿瘤细胞而言，它可能涉及细胞的浸润与转移特性，因此研究癌细胞的粘弹性并阐明其在肿瘤细胞发生、生长、转移等过程的作用，是十分必要的。近年来，肿瘤细胞细胞骨架与其生物学特性的关系愈来愈受到重视^［1］，以细胞骨架为靶细胞器的化疗药物(如长春花碱)已被广泛地用于肿瘤的临床治疗，但有关肿瘤细胞细胞骨架结构与其流变特性的相关性，目前尚未见系统报道，本研究以正常肝细胞和肝癌细胞为研究对象，用微管吸吮技术(micropipette aspiration technique)研究了长春花碱　(vinblastine, VBL)和细胞松驰素D(cytochalasin D,CD)对两种细胞粘弹性的影响，旨在从细胞骨架角度研究并阐明肝癌细胞粘弹性改变的基础上，在亚细胞水平更好地认识癌细胞的粘弹特性。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞样本的制备

　　肝细胞由正常肝组织经0.05%胶原蛋白酶IV(Sigma产品)消化后用梯度离心的方法分离和纯化制得^［2］，人肝癌细胞(SMMC-7721)购自第二军医大学，两种细胞均经0.02%EDTA/0.05%胰蛋白酶混合液消化后悬浮于RPMI1640细胞培养液中制成细胞悬液，浓度约5×10⁶个细胞/毫升，CD的处理是在细胞悬液中加入0.25～5.0mg/ml的CD，37℃孵育30min后进行微管吸吮实验；VBL的处理是在细胞培养的上清液中加入0.05～2.00mg/L的VBL，37℃孵育24h后再消化制样进行微管吸吮实验。微管吸吮实验在3h内完成。

　　1.2　微管吸吮实验系统及微管吸吮实验

　　微管吸吮实验系统的结构我们已另文报道^［3］，该系统由倒置显微镜(Axiovert 35, Zeiss Co.)，显微操作器(MR1570，eppendort Co.)，压力控制与记录系统(本院自制)，电视摄像和磁带录像机(NV-HD100MC，Panasonic Co.)以及图象处理仪(Vidas 21,Kontron Co.)等部分组成。其中，微管由普通国产毛细玻管在微管拉制器(P87, Sutter Instrument Co.)上控制而成，内半径2.67±0.82μm。

　　系统连结完毕后，取细胞悬液约0.5ml放入一特制圆形小室内，置于倒置显微镜载物台上，在(×100)油镜，(×10)目镜下确定待实验的细胞，利用显微操作器引导微管尖端靠近细胞的表面，通过压力控制系统产生一阶跃负压(CD 149.6±50.5Pa,n=234;VBL358.5±79Pa,n=230)，以吸吮细胞，使细胞的一小部分被吸入微管内。实验中，以电视摄像磁带记录的方式记录细胞进入微管的变形过程，经电视回放输入图象处理仪进行有关测量^［4］。

　　1.3　计算与统计分析

　　细胞在微管内的变形表现为一个初始的快速弹性响应和其后的一个蠕变过程，我们采用了三参数标准线性固体模型(Kelvin模型)拟合实验结果^［5］。该模型由二条平行的“臂”组成，其中一“臂”为弹性系数为K₁的弹性元件，另一“臂”由弹性系数K₂的弹性元件和粘性系数为μ的粘性元件串联而成，实验结果表述中以K₁、K₂和μ作为标准细胞粘弹性的客观物理量，在这里，弹性系数K₁和K₂与时间无关，它们反映了细胞的刚性，粘性系数μ描述了细胞变形时时间的依赖性，它反映了细胞的粘性，细胞的初始变形程度正比于［1/(K₁+K₂)］，最大变形程度正比于1/K₁。细胞粘弹性系数是细胞本身的材料属性，细胞小变形条件下通过Kelvin模型反映的细胞粘弹性主要是受胞质内细胞骨架结构和机能状态的完整性所影响，为保证细胞在微管内的小变形状态，我们对VBL和CD处理后的细胞采用了不同的负压吸吮，实验结果统一采用了两样本均数的t检验进行显著性分析。

　　2　结果

　　长春花碱和细胞松驰素D作用下肝细胞和肝癌细胞粘弹性系数变化如表1和表2。

表1　长春花碱作用下肝癌细胞和肝细胞粘弹性系数

　　与相应对照组比较：* P＜0.05, ○ P＜0.01，△ P＜0.001;n：所测细胞个数

表2　细胞松驰素D作用下肝癌细胞和肝细胞粘弹性系数

　　与相应对照组比较：* P＜0.05, ○ P＜0.01， △ P＜0.001; n：所测细胞个数

　　3　讨论

　　长春花碱属生物碱类抗微管药物，主要阻止微管蛋白装配成微管，细胞松驰素D是微丝的特效干扰剂，可引起微丝网架的解体^［7］，从两种细胞粘弹性系数数据上可看出，肝细胞和肝癌细胞存在明显差异。无药物对照组肝癌细胞的弹性系数K₁、K₂较肝细胞相应值明显增高(P＜0.01)，这表明在实验条件下肝癌细胞较肝细胞刚性增加，这也预示着细胞癌变后由于其骨架结构和机能状态的异常对其流变特性的影响。VBL在0.05～2.00mg/L的浓度范围内引起肝细胞K₁、K₂和μ值均明显增高，肝癌细胞K₁值在0.05mg/L作用下明显增高，浓度增高时呈浓度依赖性下降，K₂和μ值则呈单调浓度依赖性下降。CD在0.25～5.00mg/L浓度范围内引起两种细胞粘弹性系数均显著性下降，相同浓度CD作用下，癌细胞粘弹性系数下降幅度较之肝细胞相应幅度大，比较两种骨架干扰剂作用癌细胞的情况，CD作用下其粘弹性系数下降幅度亦为最大，这预示着微丝结构被破坏可能较微管对细胞粘弹性的影响更为显著。

　　细胞粘弹性是反映细胞流变特性的重要生物物理参数，本研究所用两种骨架干扰剂对肝细胞及肝癌细胞粘弹性系数均有显著性影响，这表明微管和微丝结构的完整性是维持肝细胞和肝癌细胞粘弹特性及相应被动变形要能的必要条件，骨架干扰剂对两种细胞粘弹性系数的效应方式和效应强度明显不同，这提示癌细胞较正常细胞在骨架结构和机能状态上的差异，这与文献报道^［1，8］是一致的。

　　两种细胞在CD作用时其粘弹性系数均大幅度减小，这可能是因为CD破坏了紧贴细胞膜下的含丰富肌动蛋白纤维的凝胶层，影响了其强度和韧性。VBL研究所用浓度的低剂量区是该药开始抑制到100%地抑制了3T3细胞增强的浓度范围^［9］，高剂量区是该药化疗时在体内的理论分布浓度范围^［10］，VBL作用下肝癌细胞的粘弹性系数K₁、K₂和μ基本上单调浓度依赖性下降，这在一定程度上可能反映了该药临床化疗时的细胞流变学效应。有关这一问题我们将从细胞粘附力学的角度作进一步深入研究。

　　国家自然科学基金资助项目(39370198)

　　张钢,现为第三军医大学高原医学系病理生理学教研室讲师,博士生(400038)

参考文献

　　［1］　Ben-Ze′ev A. The cytoskeleton in cancer cells. Biochim Biophys Acta, 1985,780:197

　　［2］　Braet F, Zanger RD. Assessment of a method of isolation, purification and cultivation of rat liver endothelial cells. Lab Invest, 1994,70:994

　　［3］　吴泽志，李志清，龙勉等.烧伤大鼠粒细胞与内皮细胞粘附力学特性的研究.生物医学工程学杂志，1996，13：219

　　［4］　吴泽志，张钢，王宪航等.肝细胞粘弹性及其与细胞骨架结构的相关性研究.生物医学工程学杂志，1997，14(2)：111～114

　　［5］　Sung K LP, Sung LA, et al. Dynamic changes in cytotoxic T-lymphocyte-mediated killing, J Cell Sci, 1988,91:179

　　［6］　Chien S, Sung KLP. Effect of colchicine on viscoelastic properties of neutrophils. Biophy J, 1984,46:383

　　［7］　杨抚华.医学细胞生物学概论.成都：四川科学技术出版社，1991，269

　　［8］　陈尊器，葛日萍.肝细胞转化中细胞骨架的改变.广州医学院学报，1989，17：6

　　［9］　Kawech N, Seif R. Effect of microtubule disorganizing or overstabilizing drugs on the proliferation of rat 3T3 cells and their virally induced transformal derivatives, Cancer Res, 1988,48:4892

　　［10］　李振.恶性肿瘤的化学治疗与免疫活疗.北京：人民卫生出版社，1993，118

收稿日期：1997-07-16