XTT-PMS法检测肝癌细胞的生长与药物敏感性

唐毅 刘建伟 李斯明 沈雁 钟灿灿

　　材料与方法

　　1. 主要试剂：MTT、XTT、PMS、DMSO（Sigma公司产品)，RPMI

　　1640（Gibco公司），氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司），注射用盐酸阿霉素（深圳万乐药业有限公司)，注射用丝裂霉素Ｃ（协和发酵工业株式会社），新生小牛血清（杭州四季青公司提供）。

　　2. 细胞与细胞培养：人肝癌细胞系 BEL-7402置含10%新生小牛血清的RPMI

　　1640培养液中，于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。每两天换液一次，细胞汇合后，胰酶消化，传代。

　　3. MTT比色分析法：MTT的配制：以PBS配制成5mg/ml贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光可以保存一周，使用时以无血清培养液稀释成1mg/ml。

　　肝癌细胞药敏性测定：先以100μl/孔接种细胞（细胞浓度为10⁴/ml），培养24h后，加入100μl/孔的相应药物，再培养6d后，以50μl/孔加入MTT（1mg/ml)，继续培养4h，弃上清液，加入150μl/孔的DMSO，振荡，待甲簪完全溶解后，以570nm的波长测定光密度(A）值。结果以测定值减背景（本底）值表示。

　　4. XTT比色分析法：XTT的配制：以无血清培养液配制成1mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，现配现用。

　　PMS的配制：以PBS配制成5～100mmol/L的贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存，一般不超过一个月。XTT-PMS使用液：在新配制的XTT（1mg/ml）加入一定量的PMS即可，立即使用。XTT测定方法：接种肝癌细胞于96孔培养板培养，加入50μl/孔的XTT-PMS使用液，继续培养一定时间后，振荡，以450nm的波长测定吸光度（A）值。XTT测定肝癌细胞药敏性操作大体同上。

　　5. 数据资料用SPSS 8.0软件分析。

　　结果

　　1. PMS对XTT-PMS测定的影响：以10³细胞每孔接种96孔培养板，培养7d，分别行MTT、XTT-PMS法测定。在无PMS的条件下，肝癌细胞代谢XTT的能力很差，PMS能显著地促进肝癌细胞代谢XTT，PMS浓度为5μmol/L，培养2h后，XTT-PMS法测定的A值达0.66±

　　0.07，与常规MTT法测定结果(A 值为0.64±0.03）相似。随着PMS浓度增大或培养时间的延长，A值随着增高，但XTT-PMS所形成的本底值即背景值也随之增大。

　　2. XTT-PMS测定肝癌细胞数的范围：培养时间为4h、PMS浓度为5μmol/L时，XTT-PMS

　　法测定的A 值明显高于MTT法，其测定的肝癌细胞数范围为10²～6×10⁴，而MTT法测定的范围为10⁴～6×10⁴。

　　3. 肝癌细胞药敏性测定结果：XTT-PMS（培养时间为4h、PMS浓度为5μmol/L)及常规MTT法测定肝癌细胞药敏性的结果见表1，IC₅₀表示肝癌细胞50%抑制率时药物浓度，两种方法测定的结果基本相同。表1 MTT、XTT-PMS法测定的IC₅₀值

　　药物　　　　氟尿嘧啶　　　盐酸阿霉素　　丝裂霉素C

　　MTT　　　　0.02μg/ml　　28.73ng/ml　　　0.42μg/ml

　　XTT-PMS　　0.02μg/ml　　26.92ng/ml　　　0.38μg/ml

　　讨论

　　XTT 是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的棕黄色甲簪产物。我们将XTT-PMS法应用于肝癌细胞的活性检测，发现肝癌细胞对XTT的代谢能力较差，在电子偶联剂PMS的共同作用下，细胞代谢XTT的能力显著增强。选择适宜的电子偶联剂浓度及作用时间，可获得比MTT方法更灵敏、更准确的结果。对肝癌细胞来说，XTT-PMS法检测的适宜条件为XTT0.2mg/ml，PMS浓度5～50μmol/L，作用时间2～6h，检测细胞数范围略大于MTT法，检测过程中的变异系数比MTT法小。其检测肝癌细胞药敏性的结果与MTT法相似。XTT-PMS法中细胞代谢产物为水溶性，可直接测定，所以，XTT-PMS法除具有MTT法的优点外，操作更简便、快速，可应用于涉及肝癌细胞活性检测的临床药敏试验及有关抑癌药物的筛选等研究。

作者单位：广州市创伤外科研究所，510220