人乳腺癌细胞MTT药敏试验评价标准的研究
癌症 1999年第3期第18卷 基础研究
作者：徐建明 宋三泰 汤仲明 江泽飞 刘晓晴 刘广贤 周莉 张婧
单位：军事医学科学院附属医院(北京，100039) △军事医学科学院放射医学研究所(北京，100850)
关键词：人乳腺癌细胞；MTT比色法；药物敏感性；评价标准
【摘要】目的：建立人乳腺癌细胞体外药敏评价标准，预测乳癌病人的化疗疗效。方法：应用MTT试验，检测175例原代乳腺癌细胞对8种化疗药物的敏感性，采用Logistic程序对药物敏感性的指标进行分析。结果：如果Imax％＞(瘤群Imax％均数＋标准差)，说明药物的抑制作用较弱，临床不能应用该药；如果Imax％≤(瘤群Imax％均数＋标准差)药物的抑制作用较强，可以进一步考证其IC50。IC50≤Q50，即小于本组瘤群IC50的中位值，则判定该例乳腺癌对药物相对敏感，反之则为相对耐药。结论：联合应用Imax％和IC50的药敏评价标准，能较客观地反映人乳腺癌细胞体外的药物敏感性，有利于预测乳癌病人的化疗疗效。
中图号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(1999)03－0260－03
Studies of evaluable criteria for in vitro chemosensitivity
using MTT assay in human breast cancer cells
XU Jian-ming, SONG San-tai, TANG Zhong-ming,et alBeijing 307 Hospital, Cancer Center,Beijing 100039,China
【Abstract】Objective：To establish evaluable criteria of in vitro chemosensitivity for predicting clinical response of chemotherapy in breast cancer patients.Methods：The chemosensitivity of 175 human breast cancers to 8 antitumor drugs was measured by MTT assay,respectively and the Imax％ and IC50 by logistic analysis of the dose-response curve was evaluated.Results：If imax％ ＞mean Imax％＋SD which was obtained from the Imax％s of tumor samples, the drug was ineffective to this tumor sample.If the Imax％ ≤ mean Imax％＋SD,the cytotoxicity was greater. Then we would compare its IC50 with the value of Q50 which was used as cut-off between sensitivity and resistance.If its iC50≤the value of Q50,this tumor sample was relatively sensitive to the drug.Otherwise,it was resistant to the drug.Conclusion：The evaluable criteria which were first determined by Imax％ and iC50 form Chinese breast cancer tissues may objectively predict the in vitro chemosensitivity. It makes this assay feasible for directing chemotherapy to breast cancer patients.
Key words： Breast neoplasms;MTT colorimetry;Chemosensitivity;Criteria
近年来，MTT法的药敏试验在肿瘤预见性化疗中的作用逐渐为大家所接受〔1，2〕，但是，药敏评价体系还存在诸多缺点。为此，我们曾研究分析过32例乳腺癌MTT试验的药敏指标，初步形成了乳腺癌的体外药物敏感性评价标准〔3〕。目前，共积累175例乳腺癌标本的药敏数据，结合临床疗效的反馈信息〔4，5〕，重新修订评价标准，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、培养液及仪器见文献〔3〕
1.2抗肿瘤药物
选阿霉素(ADM)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、长春新碱(VCR)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、米托蒽醌(Mx)、长春花碱酰胺(VDS)等8种。所有药物先用磷酸盐缓冲液(PBS)配成母液，－20℃贮存，测试前各种药物都用培养液稀释成6个梯度浓度。因为环磷酰胺(CTX)在体外无活性，需经体内肝微粒体酶和细胞色素P－450作用，氧化、裂环成醛磷酰胺，才能对肿瘤细胞起到杀伤作用，因此，该药不宜用作体外药敏测定。
1.3 标本来源及处理
175例标本均为本院及外院手术切除的新鲜乳腺癌组织，其中，原发癌84例，复发转移癌91例。先行肿瘤印片细胞学检查，以鉴别组织的细胞学性质。细胞悬液的制备见文献〔3〕。
1.4 MTT药敏试验方法见文献〔3〕
1.5 药物体外敏感性的评价指标
由于药物抑制作用与药物浓度的关系表现为乙状Logistic函数，故通过计算机采用Logistic函数程序，对高达6个梯度浓度的大跨度多点作用的量效曲线进行综合估算〔3〕。
1.6 统计学方法
以矩法计算药敏指标的偏度系数和峰度系数，并进行正态性检验。对正态分布者，计算其均数±标准差；对偏态分布者，则求百分位数值〔6〕。
2 结果
2.1 同一药物对不同乳腺癌抑制程度Imax％的差异及其分布特点。
Imax％(Survivalrateatmaximalinhibition)代表了化疗药物达到最大抑制时，残存肿瘤细胞的存活率。Imax％越大，表示残存的肿瘤细胞越多，药物的抑制程度越小。不同病人及不同药物之间的Imax％存在差异。表1列出了本组瘤群中，8种化疗药物抑制作用最强、中等和最弱各5例的Imax％值。结果表明同一药物对大多数病例的Imax％值有所不同。一般相差1～2个数量级，CBP相差最大也仅1000倍(3个数量级)，而5－U则在同一级的水平。通过Imax％分布的矩法正态性检验，8种化疗药物对瘤群的Imax％都呈正态分布，偏离常态检验P＞0.05(表2)。
表1 8种化疗药物达到最大抑制时残存原代乳腺癌细胞存活率(Imax％)的差异
| 百分位数 |
ADM |
5－FU |
VCR |
MTX |
DDP |
CBP |
Mx |
VDS |
| 例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
例号 |
Imax％ |
| Q1 |
59 |
0.1 |
108 |
10.9 |
130 |
4.2 |
55 |
0.5 |
36 |
0.1 |
117 |
0.1 |
174 |
2.4 |
56 |
4.6 |
| 62 |
1.0 |
140 |
12.9 |
95 |
4.9 |
144 |
3.5 |
111 |
5.9 |
58 |
7.9 |
88 |
6.6 |
58 |
8.6 |
| 90 |
2.7 |
64 |
18.0 |
80 |
5.1 |
147 |
5.5 |
66 |
9.6 |
111 |
9.0 |
128 |
7.1 |
108 |
10.1 |
| 156 |
6.7 |
122 |
19.3 |
129 |
13.0 |
111 |
6.6 |
108 |
9.6 |
112 |
9.9 |
148 |
9.3 |
65 |
11.1 |
| 116 |
6.8 |
166 |
19.5 |
143 |
15.9 |
108 |
10.6 |
89 |
10.1 |
32 |
10.0 |
82 |
10.5 |
117 |
11.9 |
| Q50 |
170 |
35.3 |
117 |
42.5 |
15 |
40.8 |
30 |
45.0 |
163 |
31.4 |
152 |
37.1 |
122 |
32.3 |
138 |
30.8 |
| 34 |
35.7 |
114 |
42.5 |
171 |
40.9 |
94 |
45.0 |
117 |
32.2 |
44 |
37.2 |
154 |
32.8 |
148 |
30.8 |
| 151 |
35.7 |
26 |
42.9 |
123 |
42.1 |
64 |
45.1 |
146 |
32.2 |
88 |
37.6 |
161 |
33.1 |
104 |
30.9 |
| 50 |
35.8 |
163 |
43.0 |
154 |
42.9 |
120 |
45.7 |
161 |
32.2 |
133 |
37.6 |
29 |
33.5 |
123 |
30.9 |
| 71 |
35.9 |
17 |
43.1 |
124 |
43.1 |
28 |
46.0 |
151 |
32.4 |
105 |
38.5 |
64 |
34.4 |
120 |
31.5 |
| Q100 |
131 |
76.7 |
156 |
81.5 |
21 |
79.0 |
59 |
85.0 |
18 |
72.7 |
38 |
77.2 |
88 |
82.2 |
149 |
69.1 |
| 155 |
79.8 |
11 |
82.6 |
5 |
79.8 |
32 |
86.2 |
9 |
76.9 |
13 |
77.5 |
85 |
83.5 |
118 |
75.9 |
| 10 |
81.3 |
13 |
83.4 |
115 |
81.6 |
87 |
88.9 |
13 |
77.4 |
175 |
92.5 |
121 |
85.6 |
175 |
78.3 |
| 36 |
90.0 |
114 |
86.7 |
38 |
85.0 |
5 |
89.9 |
175 |
88.0 |
21 |
100 |
175 |
87.0 |
159 |
79.9 |
| 118 |
93.3 |
36 |
95.0 |
36 |
88.0 |
175 |
90.0 |
159 |
90.1 |
23 |
100 |
168 |
89.3 |
145 |
80.7 |
注：每种化疗药都有175例标本。表内仅显示药物达最大作用的抑制是严重、抑制中等、和抑制最轻微的各5例。Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。
表2 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制时残存肿瘤细胞的存活率(Imax％)的分布
| 药物 |
Imax％  ±s
|
Imax％ |
矩法正态性检验 |
| Q25 |
Q50 |
Q75 |
峰度系数＊
ugl |
P |
偏度系数Δ
ugl |
P |
| VDS |
30.1±13.4 |
26.0 |
30.9 |
47.0 |
0.20 |
＜0.01 |
-0.33 |
＞0.05 |
| DDP |
30.8±17.1 |
22.2 |
32.2 |
47.5 |
0.72 |
＜0.01 |
0.33 |
＞0.05 |
| Mx |
32.7±17.3 |
19.8 |
33.1 |
48.3 |
1.26 |
＞0.05 |
0.25 |
＞0.05 |
| ADM |
35.8±17.4 |
23.7 |
35.7 |
48.4 |
0.60 |
＞0.05 |
0.27 |
＞0.05 |
| CBP |
37.7±12.8 |
24.5 |
37.6 |
49.2 |
0.65 |
＜0.01 |
0.29 |
＞0.05 |
| VCR |
44.5±17.3 |
30.5 |
42.1 |
59.8 |
-0.19 |
＞0.05 |
-0.26 |
＞0.05 |
| MTX |
45.2±16.8 |
30.1 |
45.1 |
60.4 |
0.001 |
＞0.05 |
-0.32 |
＞0.05 |
| 5－FU |
46.4±5.9 |
34.5 |
42.9 |
61.6 |
0.10 |
＞0.05 |
-0.23 |
＞0.05 |
※峰度系数等于0为正态峰；大于0为尖峭峰；小于0为平阔峰。
Δ偏度系数等于0为对称峰；大于0为正偏态峰；小于0为负偏态峰。2.2 不同乳腺癌对同一药物的敏感性IC50的差异及其分布特点
我们以药物达到最大的抑制作用一半时，所需的药物浓度IC50(50％inhibitionconcentration)，来表示乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。表3列出了本组乳腺癌中，对8种化疗药最敏感、中度敏感及最不敏感各5例的IC50值。结果表明不同乳腺癌对同一药物的敏感性差异甚远，一般相差4～5个数量级，DDP竟高达10倍，而相差最小的Mx也在3个数量级。这与临床常见的，不同病人采用同一剂量的药物治疗，效果悬殊很大是相符合的。IC50分布经矩法正态性检验均呈偏移峰型分布，偏离常态检验P＜0.001（表4）。
表3 药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的差异
| 百分
位数 |
ADM |
5-FU |
VCR |
MTX |
DDP |
CBP |
Mx |
VDS |
| 例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
例号 |
IC50 |
| Q1 |
107 |
1.5×10-9 |
15 |
2.3×10-8 |
1 |
1.2×10-9 |
141 |
3.2×10-8 |
141 |
6.7×10-9 |
128 |
1.5×10-8 |
170 |
1.2×10-8 |
149 |
2.0×10-10 |
| 135 |
6.6×10-9 |
10 |
3.1×10-8 |
24 |
1.5×10-9 |
51 |
4.5×10-8 |
172 |
8.3×10-9 |
18 |
2.0×10-8 |
90 |
1.4×10-8 |
172 |
7.0×10-10 |
| 172 |
2.3×10-8 |
7 |
4.6×10-8 |
131 |
1.6×10-9 |
26 |
4.8×10-8 |
128 |
2.1×10-8 |
172 |
2.0×10-8 |
162 |
1.6×10-8 |
111 |
1.2×10-9 |
| 133 |
2.9×10-8 |
141 |
5.2×10-8 |
11 |
3.3×10-9 |
27 |
4.9×10-8 |
126 |
2.2×10-8 |
79 |
2.0×10-8 |
88 |
1.6×10-8 |
135 |
1.2×10-9 |
| 91 |
3.8×10-8 |
1 |
8.2×10-8 |
19 |
3.3×10-9 |
44 |
5.2×10-8 |
109 |
3.1×10-8 |
166 |
2.3×10-8 |
118 |
1.8×10-8 |
174 |
1.3×10-9 |
| Q50 |
121 |
1.9×10-7 |
101 |
6.1×10-7 |
146 |
7.6×10-8 |
63 |
3.5×10-7 |
57 |
6.8×10-7 |
94 |
6.7×10-8 |
12 |
1.1×10-7 |
97 |
7.4×10-9 |
| 122 |
1.9×10-7 |
148 |
6.1×10-7 |
165 |
7.7×10-8 |
31 |
3.6×10-7 |
4 |
6.9×10-7 |
129 |
7.0×10-8 |
167 |
1.2×10-7 |
80 |
7.6×10-9 |
| 162 |
1.9×10-7 |
28 |
6.2×10-7 |
148 |
7.8×10-8 |
16 |
4.2×10-7 |
115 |
7.3×10-7 |
70 |
7.4×10-8 |
71 |
1.2×10-7 |
153 |
7.7×10-9 |
| 88 |
2.0×10-7 |
465 |
6.3×10-7 |
23 |
8.0×10-8 |
2 |
4.3×10-7 |
125 |
7.4×10-7 |
86 |
7.4×10-8 |
89 |
1.2×10-7 |
104 |
7.8×10-9 |
| 97 |
2.0×10-7 |
97 |
6.4×10-7 |
80 |
8.0×10-8 |
24 |
4.3×10-7 |
90 |
7.7×10-7 |
90 |
7.5×10-8 |
175 |
1.3×10-7 |
168 |
7.9×10-8 |
| Q100 |
46 |
2.4×10-5 |
74 |
2.1×10-5 |
147 |
1.3×10-5 |
55 |
2.2×10-5 |
124 |
8.3×10-5 |
28 |
7.9×10-5 |
78 |
3.1×10-7 |
159 |
7.9×10-7 |
| 59 |
3.4×10-5 |
3 |
2.4×10-5 |
39 |
2.0×10-5 |
23 |
2.2×10-5 |
43 |
1.2×10-4 |
6 |
5.3×10-4 |
74 |
3.7×10-7 |
175 |
1.1×10-6 |
| 74 |
7.0×10-5 |
114 |
6.7×10-5 |
106 |
3.8×10-5 |
13 |
2.2×10-4 |
28 |
1.5×10-4 |
14 |
2.7×10-3 |
121 |
3.9×10-7 |
59 |
1.2×10-6 |
| 62 |
7.9×10-5 |
28 |
8.0×10-5 |
36 |
1.1×10-4 |
59 |
2.2×10-4 |
23 |
2.2×10-4 |
21 |
2.7×10-3 |
177 |
3.3×10-8 |
74 |
4.8×10-6 |
| 36 |
1.7×10-4 |
36 |
7.7×10-4 |
38 |
1.1×10-4 |
45 |
2.2×10-4 |
6 |
2.6×10-3 |
23 |
2.7×10-3 |
58 |
1.9×10-5 |
117 |
1.1×10-6 |
注：每种化疗药都有175例标本，表内仅显示最敏感，中度敏感和最抗药的各5例。
Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。药物浓度：毫克分子数/毫升
表4 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的分布
| 药物 |
IC50±s |
IC50 |
|
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