竞争性定量聚合酶链反应检测幽门螺杆菌cagA基因

中华医学检验杂志 2000年第2期第23卷 论著摘要

作者：韩锋产　阎小君　苏成芝

单位：韩锋产（710033 西安，第四军医大学全军基因诊断技术研究所）；阎小君（710033 西安，第四军医大学全军基因诊断技术研究所）；苏成芝（710033 西安，第四军医大学全军基因诊断技术研究所）

　　关键词： 螺杆菌；幽门；基因；结构；细菌；聚合酶链反应

　　 【摘要】目的　建立竞争性聚合酶链反应（PCR）定量检测幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白基因A（cagA）的方法。方法　以重组PCR将乳糖操纵子中乳糖调节蛋白(LacI)的特异性结合序列（21 bp）插入cagA基因的一段序列（400 bp）中得到重组cagA基因片段(rfcagA)。体外克隆并表达谷胱甘肽转硫酶-LacI(GST-LacI)的融合蛋白，其一端具有GST活性，另一端可特异性地与rfcagA结合。在定量PCR中，以rfcagA为内参标模板，pMC3或Hp基因组cagA作为竞争性模板，PCR产物的5′-端标记了生物素，可与包被了亲和素的微孔板结合。只有rfcagA的PCR产物可与融合蛋白结合而显色。结果　GST底物的显色程度与样本的cagA含量呈负相关，当反应体系中的起始模板量为10～10⁵拷贝，循环次数小于或等于20次,原始模板数以指数方式增长,并建立了原始模板的对数与A₃₄₀值间的标准曲线。用该方法检测14份已知菌液中的cagA，9份阳性,5份阴性，符合实际情况；cagA的拷贝数为6.3×10¹⁰～2.14×10¹¹/L。结论　这是一项特异、敏感及实用的定量检测cagA基因的技术。

Quantitative detection of cagA of helicobacter pylori by competitive PCR

HAN Fengchan,YAN Xiaojun,SU Chengzhi.

　　Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, Xi′an 710033, China

　　 【Abstract】Objective　To establish a method for quantitative detection of cytotoxin associated gene A (cagA) positive Helicobacter pylori (cagA⁺ Hp) by competitive polymerase chain reaction. Methods　The lactose regulatory protein (LacI) specific combining sequence (the lactose operator, 21 bp) was inserted into the cagA fragment (fcagA, 400 bp) by overlapping extension PCR. By cloning lactose regulatory gene (lacI) into pGEX-4T-3, transforming E.coli JM109 with pGEX-4T-3/lacI, and inducing the bacterium with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）, we got the active fusion protein of glutathione-s-transferase (GST) and LacI. In the competitive PCR， rfcagA was used as the internal standard template and pMC3 that contained most part of cagA from the 5′-end or Hp cagA as the competitive one. Since one primer of the PCR was labelled with biotin at the 5′-end, the PCR products could conjugate to the microplate wall that coated with avidin. When the GST-LacI was added to the walls, only the products containing the lactose operator sequence could combine with it, and the GST could catalyze 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and glutathione to form a substance that had the maximal ultraviolet(340nm) absorbance. Results　When the copies of the internal standard was fixed (100 copies), a standard curve of A₃₄₀ against the logarithmic value of the competitive templates was established. Using this method, we found that, among the 14 bacteria cultural media, 9 were cagA positive with the copies from 6.3×10¹⁰/L to 2.14×10¹¹/L. The coincidentce rate was 100%. Conclusion　This is a specific,sensitive and applicable method for quantitative detection of cagA.

　　 【Key words】Helicobacter pylori;Genes, structural, Bacterial;Polymerase chain reaction

　　幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）在上消化道疾病的发生中起着十分重要的作用。现已确认Hp是慢性胃炎的主要病原菌，与消化性溃疡及胃癌的发生密切相关。自从公布了Hp 细胞毒素相关蛋白基因A（cytotoxin associated gene A， cagA）的序列以后，国内外学者对cagA阳性Hp的研究日趋深入。本研究拟建立竞争性定量聚合酶链反应(PCR)检测cagA基因的方法。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1.材料：cagA阳性Hp菌株（ATCC53726）：美国Vanderbilt大学卜昕博士惠赠；Hp临床分离株10株：取患者胃粘膜活检组织，微需氧条件下培养。由第四军医大学西京医院消化内科及第一军医大学南方医院消化病研究所提供。pGEX-4T-3：本所保存；pMC3：为含cagA基因5′-端大部的pBluescript质粒，由美国Vanderbilt大学Tummuru博士惠赠。Taq DNA聚合酶：上海复华生物工程公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），华美公司；亲和素（分子量：66 000）：原平生物工程公司；还原型谷胱甘肽(GSH)：华美公司；1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）：北京化学试剂厂；Glutathione Sepharose 4B：Pharmacia公司；PCR扩增仪(Therolyne Amplitron Ⅱ)：Barnstead公司；373A型全自动DNA序列分析仪：PE公司；Bio-Rad mini-proteinⅡ电泳系统：Joss Bio-Lab公司；DU-640型核酸蛋白分析仪：Beckman公司。

　　二、方法

　　（一）内参标模板rfcagA的构建

　　1.PCR引物设计：根据已报道的cagA基因的序列^［1］及LacI蛋白的特异性结合部位的序列设计3对PCR引物：p1～p6。其中p1及p2用于扩增cagA基因中400 bp的片段，在p1之5′-端结合了生物素；用p3与p5、 p4与p6分别扩增400 bp cagA基因片段的两端。在p5的5′-端引入LacⅠ蛋白的特异性结合序列（21 bp），在p6的5′-端引入了p5的 5′-端21个碱基的反义DNA序列。

　　2.PCR反应及测序：参考文献进行PCR反应^［2］。以pMC3为模板，分别以p3和p5、p4和p6为引物做PCR，得到产物AB及CD。将AB和CD等量混合做重叠延伸PCR，得到产物AD（rfcagA），克隆入pUC19进行序列测定。

　　（二）融合蛋白（GST-LacI）的表达

　　1. lacI基因的克隆及表达：设计PCR引物（lacIp1: 5′-ACGTGAATTCGAAACCAGTAACTTTATAC-GATG-3′；lacIp2:5′-GTCGACCTCACTGCCCGCTTTCC-AGTC-3′），从天然大肠埃希菌DNA中扩增lacI基因。测序正确后将lacI基因克隆入表达载体pGEX-4T-3，转化大肠埃希菌（JM109），IPTG诱导GST-LacI融合蛋白的表达。12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察重组蛋白的表达。

　　2. 表达产物的变性、复性及纯化：GST-LacI包涵体的变性及复性参考文献进行^［3］。采用GST亲和层析法纯化GST-LacI。

　　(三) GST-LacI结合rfcagA的活性鉴定

　　将10 μl rfcagA (0.5 g/L)与10 μl GST-LacI（1.0 g/L）混合，37℃水浴30 min,在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳,溴化乙啶染色，观察rfcagA结合GST-LacI前后迁移速度的变化，同时以BSA作为对照品与rfcagA结合。

　　（四）竞争性定量PCR检测cagA基因方法的建立

　　1.PCR模板的制备：参照文献进行^［4］。Hp DNA按菌液体积的10³倍悬浮作模板。

　　2.亲和素包被聚苯乙烯微孔板：参考文献进行^［5］。

　　3.竞争性PCR扩增cagA片段：PCR反应的总体积为50 μl,其中dNTPs各0.2 mmol/L，引物p1及p2各0.2 μmol/L，竞争性模板5 μl，内参标模板(rfcagA) 100个拷贝，Taq DNA聚合酶2 U，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂。扩增条件为：94℃变性35 s,55℃退火45 s，72℃延伸60 s,循环次数分别为5次，10次，15次，20次，25次，30次，35次，40次，最后于72℃下再延伸2 min。

　　4.PCR产物的定量分析：将不同循环次数下扩增的PCR产物进行不同倍数（2～10⁵）的稀释（稀释液为0.1 mol/L马来酸，0.15 mol/L NaCl），加100 μl于聚苯乙烯微孔板中，室温放置20 min,弃去，用洗涤液洗板3次；加入GST-LacI 100 μl（25 μg）,放37℃水浴5 min，弃去，以洗涤液洗5次；加入于37℃预热的基质液（含0.1 mol/L GSH、CDNB及PB-pH 8.0）100 μl，置37℃作用1 min；立即将反应板放入60℃水浴10 min，取50 μl在分光光度计上（波长340 nm，比色杯光径1 cm）测A₃₄₀值。同时设空白、阳性、阴性及标准品对照。

　　结果

　　1.内参标模板rfcagA的构建：对重组PCR产物做1.7%琼脂糖凝胶电泳，可见大小约400 bp条带，与预计大小相符(图1)。测序表明其一级结构完全正确。

1、2、3：rfcagA；4：PCR DNA参照标准

1　重组内参标模板凝胶电泳结果

　　2.融合蛋白（GST-LacI）的表达：(1)lacI基因的制备：lacI基因的PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，可见一大小约为1 081 bp的片段(图2)。序列测定结果与已知的序列一致。(2)lacI基因的表达：在IPTG(0.5 mmol/L)诱导下，pGEX-4T-3/lacI转化菌（JM109）表达分子量62 000的融合蛋白（GST-LacI）, 诱导4h表达量达最大，占菌体蛋白的27%(图3)。 该蛋白主要以包涵体的形式存在，对其进行复性及亲和色谱纯化，做12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，仅见一条分子量62 000的蛋白带。

1：PCR DNA参照标准；2、3、4：lacI PCR产物

2　lacI基因PCR产物电泳结果

1：诱导的JM109；2：诱导的pGEX-4T-3-JM109；3：诱导的pGEX-4T-3/lacI-JM109；4：蛋白质分子量标准

3　lacI基因的诱导表达结果

　　3.GST-LacI结合rfcagA的活性：将10 μl rfcagA (0.5 g/L)与10 μl GST-LacI （1.0 g/L）混合，37℃作用30 min，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可见结合GST-LacI后，rfcagA的迁移速率减慢，而与BSA相混合的rfcagA迁移速率未见改变。

　　4.细菌培养液中cagA含量的检测：以rfcagA为内参标模板（100拷贝），以pMC3为标准竞争性模板（10～10⁵拷贝），做20次循环的PCR,建立竞争性定量PCR标准曲线：y=1.08-0.154x（r=0.996,y为A₃₄₀值，x为竞争性模板以10为底的对数）；然后以rfcagA为内参标模板，以Hp DNA为待检模板做竞争性PCR。根据Hp cagA抑制rfcagA扩增的程度，借助竞争性定量PCR的标准曲线及回归方程，求得细菌培养液中cagA的拷贝数。在该条件下，对14份已知细菌培养液做cagA的检测，按待测标本A₃₄₀＞2倍阴性对照A₃₄₀为阳性判断标准，结果有9份菌液cagA阳性，5份菌液cagA阴性,符合率为100%。定量检测菌液中cagA含量范围为6.3×10¹⁰～2.14×10¹¹拷贝/L。另外，对2份cagA阳性菌液做2倍稀释后，用本法也能检出cagA的差别来。

　　讨论

　　目前，检测Hp感染的方法主要有两大类——胃镜依赖性及非依赖性方法。胃镜非依赖性方法包括血清学方法及尿素酶呼气试验等，这类方法对患者痛苦小，但血清学方法为间接性检测，呼气试验的特异性比较差。胃镜依赖性方法包括细菌的直接镜检、培养及基因诊断等，这类方法对患者痛苦较大，且细菌的直接镜检及培养敏感度较低。基因诊断中的PCR特异性强、敏感度高，很有前途。但随着对Hp研究的深入，定性PCR已不能满足临床上的需要。

　　定量PCR是根据PCR的产物量来推断其原始模板量。在诸多的定量PCR中，只有竞争性定量PCR实现了同引物同条件下的PCR扩增，其中内参标模板的设置最为关键。在Hp尿素酶的竞争性定量PCR检测方面，Furuta等^［6］以人工合成的寡核苷酸作为内参标模板，根据靶基因与内参标模板PCR产物长度的不同对二者加以区别，通过比较凝胶电泳条带的深浅而定量。但两种模板的长度差别很大，会影响PCR扩增的效率，且靠凝胶电泳中核酸条带的深浅来定量难尽人意。Monteiro等^［7］采用一个非同源性DNA片段连接到靶基因PCR引物结合序列的中间构成内参标模板，用同一套引物扩增内参标模板及靶序列，通过PCR产物的探针杂交检测靶基因的扩增量，但该内参标模板与靶基因的扩增效率还是有较大的差别。而在本试验中，我们采用重组PCR所获得的定量检测cagA的内参标模板与靶基因具有相同的引物结合位点及近似的长度，是理想的内参标模板。

　　Wahlberg等^［8］曾利用LacI与lac操纵基因特异结合的性质，通过酶促显色检测沙眼衣原体的感染。藉此，我们在对PCR产物做定量分析时采用了一种双功能融合蛋白（GST-LacI）。其中LacI能与内参标模板中的lac操纵基因特异性地结合，而GST则通过与其底物的作用产生特殊波长（340 mm）的紫外光吸收，从而根据紫外吸收值推断出内参标模板的扩增量，进而得知靶基因的原始量。 通过对14份已知细菌培养液做cagA的检测，结果与实际情况完全相符，体现出了很高的特异性。利用酶促放大作用分析PCR产物，使定量在PCR扩增的指数增长期进行成为可能，同时亦提高了对PCR产物检测的灵敏度（较凝胶电泳法观察结果的敏感度大大提高）。经过对2份倍比稀释的cagA阳性Hp菌液中cagA的检测，本方法区分出了cagA基因2倍的差别。显色反应是在微孔板内进行的，这既省去了PCR产物的凝胶电泳，又能适应于大样本的操作。另外，待测模板可在较大范围内（10～10⁵）利用标准曲线获得定量，这增加了本方法的适用性。目前，我们正在采用本方法对组织中的cagA⁺ Hp做定量检测。

　　应该指出本方法中的标准竞争性模板(pMC3)与样本中的cagA抑制内参标模板（rfcagA）的效率是有差别的，故这样获得的定量结果仅是一个相对值。

参考文献

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　　2　Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al. Engineering hybrid genes without use of restriction enzymes:gene splicing by overlap extension. Gene, 1988, 77:61-68.

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　　4　Hammar M, Tyszkiewicz T, Wadstrom T, et al. Rapid detection of helicobacter pylori in gastric biopsy material by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992,30:54-61.

　　5　韩锋产，阎小君，肖乐义，等. 用PCR产物的探针杂交显色法快速检测血清中HBV DNA. 第四军医大学学报，1998，19：479-480.

　　6　Furuta T, Kaneko E, Suzuki M, et al. Quantitative study of helicobacter pylori in gastric mucus by competitive PCR using synthetic DNA fragments. J Clin Microb, 1996,34:2421-2425.

　　7　Monteiro L, Hua J, Birac C, et al. Quantitative polymerase chain reaction for the detection of helicobacter pylori in gastric biopsy specimens. J Clin Microb, 1997,35:525-526.

　　8　Wahlberg J, Lundberg J, Hultman T, et al. General colorimetric method for DNA diagnostics allowing direct solid-phase genomic sequencing of the positive samples. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:6569-6573.

收稿日期：1999-07-27