幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆及高效分泌表达

　　军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期

刘纯杰　张兆山　李淑琴　黄翠芬

　　摘　要　目的：从幽门螺杆菌(Hp)分离热休克蛋白A基因，并实现在大肠杆菌中的融合分泌表达。方法：提取Hp染色体DNA,用PCR方法扩增hspA基因。经克隆、测序后，构建融合分泌表达载体pMAL-HspA，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达。结果：分离得到了高度保守的354 bp的hspA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的融合分泌表达。在37℃诱导表达3 h后，其融合分泌表达蛋白可占细菌周质总蛋白的66.6%。该表达带可被抗Hp的特异抗体所识别。结论：幽门螺杆菌hspA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。

　　关键词：螺杆菌，幽门；热休克蛋白；聚合酶链反应；尿素酶

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性活动型B型胃炎、胃和十二指肠消化性溃疡的主要病因，同时与胃腺癌、胃淋巴瘤的发生也密切相关^［1～3］。Hp感染呈全球分布，感染率之高仅次于龋齿,居第二位。在发达国家，Hp的感染率可达30％～50％；在经济欠发达国家，80％以上的成年人感染该菌。据初步调查，我国感染率为50％～80％。Hp一经获得便可在人胃内持续数年、数十年乃至一生，在感染者中，大约有20％发展为胃病。鉴于该菌在全球范围的高感染率和明确的致病性使得如何预防和根除Hp成为目前临床上尤为重要的研究课题，而发展疫苗来防治本病则是人们优先考虑的问题。

　　Hp的候选疫苗抗原应具有免疫原性、保护力、表面暴露和高度保守性等特征，这些抗原主要有：尿素酶^［4］、热休克蛋白^［5］、VacA蛋白^［6］及过氧化物酶^［7］等。其中热休克蛋白的亚单位A即 hspA,因其独特的结构以及和尿素酶功能活性的关联性，被人们认为是激发机体对Hp产生有效免疫防治的重要组分之一^［8］。我们对hspA基因进行了克隆并实现了高效分泌表达，为Hp疫苗的研制打下了基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　菌株及质粒　Hp国际标准株NCTC11637和临床分离株Y₂由广州南方医院全军消化中心周殿元教授、陈烨博士惠赠。测序质粒载体pUC19和融合分泌表达载体pMAL-p2，受体菌JM109和POP6510由本室保存。

　　1.1.2　工具酶及化学试剂　限制性内切酶、T₄DNA连接酶购自New england Biolabs公司。pfu DNA 聚合酶为NSBC Sangon公司产品。DNA标记物、蛋白分子量标准购自Gibco bRL公司。IPTG和PCR产物纯化试剂盒为Promega公司产品。质粒提取纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

　　1.1.3　免疫学试剂　Hp阳性患者(胃窦粘膜尿素酶检测和病理切片检测阳性者)血清和正常人血清来自南方医院全军消化中心。兔抗Hp igG购自丹麦Dako公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Gibco bRL。生物素化羊抗人IgG购自华美生物工程公司。碱性磷酸酶标记的链亲和素购自北京中山生物技术公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Hp DNA的提取　从固体培养基上刮取适量生长状态良好的菌落，参照文献［9］提取其染色体DNA。

　　1.2.2　hspA的PCR扩增与纯化　用pfu DNA聚合酶进行PCR。其扩增参数为：95℃预变性5 min后，按94℃1 min, 55℃40 s, 72℃1 min的条件进行35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化。

　　1.2.3　DNA连接、转化与测序　质粒提取、质粒与PCR产物的酶切、DNA片段回收、连接与转化均按参考文献［9］进行。重组转化子经筛选与鉴定后采用373A dNA自动分析仪进行全自动测序。

　　1.2.4　诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析　经测序鉴定后的hspA基因重新克隆至分泌表达载体pMAL-p2中，转化宿主细胞POP6510后用IPTG诱导表达，表达产物用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

　　1.2.5　表达产物的免疫印迹分析　诱导表达产物SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析。

　　2　结果

　　2.1　Hp hspA基因的PCR扩增

　　据GeneBank中已报道的Hp的hspA基因序列，我们设计了一对PCR扩增引物，其序列为：

　　P₁：5′-ggagaattc AAGTTTCAACCATTAGGAG-3′

　　EcoRⅠ

　　P₂：5′-gttctgcag TTTAGTGTTTTTTGTGATC-3′

　　PstⅠ

　　引物P₁为HspA蛋白N端编码序列，去除了起始密码子ATG，引入了新的酶切位点EcoRⅠ；引物P₂为HspA蛋白C端编码序列的互补序列，引入了新的酶切位点PstⅠ。

　　经PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶电泳上鉴定。结果表明，从国际标准株NCTC11637和我国临床分离株均扩增得到了长度约为370 bp的DNA扩增带(图1)。

图1　Hp hspA PCR 扩增结果

　　1.Gibco 100 bp DNA梯带;2.Hp NCTC11637 hspA1;

　　3.Hp Y2 hspA2

　　2.2　hspA基因的克隆与测序

　　PCR扩增的目的产物经纯化后用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，与此同时pUC19用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳回收，在T₄DNA连接酶作用下12℃过夜连接，转化大肠杆菌JM109后挑选阳性克隆，经鉴定后进行全自动序列分析。其中Hp nCTC11637 hspA序列命名为hspA1，Hp Y₂hspA序列命名为hspA2，两者序列分析结果如下：

图2　幽门螺杆菌hspA序列测定结果黑体表示两者序列不同之处

　　2.3　hspA基因在大肠杆菌中的可溶性分泌表达

　　从pUC19-hspA中EcoRⅠ、PstⅠ双酶切回收hspA目的基因片段，并与经同样限制酶双酶切的分泌表达载体pMAL-p2相连接，构建大肠杆菌分泌表达载体pMAL-hspA1(NCTC11637)和pMAL-hspA2(Y₂)。表达载体转化宿主菌POP6510后，经质粒提取、酶切鉴定和PCR扩增筛选阳性表达克隆株POP-HspA1和POP-HspA2。

　　将含有表达质粒的单一菌落在LB培养基(含100 μg/ml氨苄西林)中37℃过夜培养，然后按1％转接至新的LB肉汤管(含0.2％葡萄糖，100μg/ml 氨苄西林) 中，继续培养至D值为0.4～0.6，加诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导表达3 h,离心收集菌体，取其周质的渗透休克液进行10％SDS-PAGE电泳分析(图3)。结果表明，经诱导后其细菌周质表达有大小约为相对分子质量58000的外源蛋白质表达带。该蛋白带与预期的融合表达蛋白大小一致。

图3　Hp hspA融合分泌表达周质蛋白SDS-PAGE分析

　　1.蛋白分子量标准；2，3.POP6510(pMAL-p2) 加与不加IPTG诱导表达；4，5.POP-HspA1加与不加IPTG诱导表达；6，7.POP-HspA2加与不加IPTG诱导表达

　　2.4　hspA在大肠杆菌分泌表达条件的优化

　　为便于今后的生产与纯化，我们初步进行了表达条件的优化与筛选，结果表明，IPTG在10^-4～10^-2 mol/L对表达蛋白的产量没有明显的影响，而表达时间和温度对特异表达蛋白带的产量有较明显的影响(图4)。经综合分析融合表达蛋白的相对含量与绝对含量，我们确定了较为理想的诱导分泌表达的条件是37℃培养3 h，此时分泌表达蛋白可占周质总蛋白的66.6％。

图4　不同温度和时间对HspA1融合蛋白分泌表达水平的影响

　　1.蛋白分子量标准；2，3.POP6510(pMAL-p2)诱　　　　导与不诱导表达对照；4，5，6.1 mmol/L IPTG诱导下30℃分别表达1,3,5 h；7,8,9.1 mmol/L IPTG诱导下37℃分别表达1,3,5 h

　　2.5　HspA表达蛋白的免疫印迹分析

　　HspA融合表达蛋白和高分子量蛋白标准一起电泳。分子量标准凝胶经考马斯亮蓝染色后电转移到硝酸纤维素膜上，而制备的目的蛋白直接电转移后进行免疫印迹分析。用兔抗Hp igG做一抗，结果在约58 000处出现一条阳性带(图5)。用Hp阳性患者血清做一抗，正常人血清做对照，也在58000处得到了弱的阳性反应带，而正常人血清对照未见任何显色条带。

图5　HspA1融合表达蛋白免疫印迹分析

　　1.蛋白分子量标准；2.POP-HspA1

　　3　讨论

　　Hp热休克蛋白是该菌的主要蛋白质和免疫原之一，在Hp对胃粘膜上皮细胞的粘附，尿素酶亚单位的运输与尿素酶复合物的装配以及刺激机体产生免疫应答等方面均起着重要作用^{［10，11］}。Hp的hspA基因与hspB基因是以双顺反子操纵子形式存在的，业已表明，两种编码蛋白均具有免疫原性且位于细菌表面，有望成为Hp亚单位疫苗的重要候选组分之一^［8］。我们克隆了hspA基因并实现了其高效分泌表达，为进一步评价其对Hp的免疫保护效应和构建基因工程亚单位疫苗打下了基础。

　　序列分析表明，尽管认为Hp菌株间的变异性较大，但hspA是相对保守的。在其全长357个核苷酸中，NCTC11637与已进行全基因组测序的Hp26695^［12］和J99^［13］的同源性均高达96％，而由其推导的氨基酸序列与已知序列100％同源。我国临床分离株Y2与26695和J99的核苷酸和氨基酸序列同源性均为98％。这样，具有高度保守性且是所有Hp菌株共同存在的抗原组分，必将在构建Hp亚单位疫苗时更具前景。

　　HspA的结构分析表明，它除了具有与其他细菌GroES蛋白同源的N端外，还具有其他GroES所缺乏的由27个氨基酸残基组成的独特的C端尾巴。此尾巴含有8个组氨酸和4个半胱氨酸，具有结合镍离子的功能，为“镍结合区”。这一功能特性使人们很自然地联想到它和Hp产生的尿素酶（一种含镍酶）会有某种必然的联系。Kansau等^［14］证实，hspA与尿素酶基因共表达时，尿素酶活性可增加4倍以上。目前大量研究表明，依靠单一的Hp保护性抗原组分做疫苗并不能获得满意结果，因此设计一种多价组合性疫苗将可能是Hp疫苗研制的方向。早期Ferrero等^［15］证明，用分别纯化的UreB和HspA作抗原联合免疫小鼠，其攻毒保护率可提高到100％。由此看来，构建hspA-ureB二价苗具有明显的应用前景，有关工作正在进行中。

　　［基金项目］　全军重点课题基金资助项目(98Z071)

　　［作者简介］　刘纯杰(1964-)，男，山西岚县人，博士。

　　刘纯杰（北京生物工程研究所， 北京　100071)

　　张兆山（北京生物工程研究所， 北京　100071)

　　李淑琴（北京生物工程研究所， 北京　100071)

　　黄翠芬（北京生物工程研究所， 北京　100071）

　　参考文献

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