幽门螺杆菌感染时胃黏膜一氧化氮合酶基因异常表达与细胞凋亡
中华内科杂志2000年第39卷第6期
李子俊 陈颜芳 林秋雄 王启仪 詹德娟 符永恒 刘婉薇
关键词：幽门螺杆菌（Hp）；一氧化氮合酶；细胞凋亡
幽门螺杆菌（Hp）是胃癌发生的高危因素之一，究其机制尚不清楚。一氧化氮（NO）是机体内的一种特殊效应分子，具有第二信使分子和靶细胞毒功能。当NO过量产生可诱发基因突变、细胞凋亡或肿瘤的发生［1］。本研究旨在探讨Hp感染状态下胃黏膜组织内一氧化氮合酶（NOS）基因表达、NO含量改变与细胞凋亡增殖变化的意义。
一、对象与方法
1．对象：经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎患者28例，其中Hp感染阳性16例，年龄24～64岁；Hp阴性12例，年龄19～56岁。正常对照组8例。内镜下于胃窦大和小弯侧、前和后壁分别活检2～3块黏膜组织行Hp病理检查及生化、分子生物学检测。Hp感染阳性组采用奥美拉唑加阿莫西林及灭滴灵正规治疗2周，停药1个月后复查内镜及Hp。
2.方法：（1）病理及Hp检测：慢性胃炎的诊断采用悉尼胃炎分级标准［2］，每级3分，累积计算每例病人胃黏膜炎症组织的病理积分数。Hp检测采用病理Warthin-Starry银染色法及快速尿素酶试验，2项均阳性为阳性，单项阳性退出试验。（2）NO代谢产物（NO2-）检测：采用Griess等［3］介绍的方法。试剂盒由北京军事医学科学院生产。（3）NOS基因表达检测：采用Qiagen公司RNA抽提试剂盒及Promega公司的反转录试剂盒，抽提胃黏膜组织总RNA并逆转为cDNA和PCR扩增。PCR引物序列有3套，①诱导型（iNOS）上游引物:5′-TCACGCTTGGGTCTTFTTCACT-3′,下游引物5′-TTGTCTCTGG-GTCCTCTGGTCA-3′；②结构型（cNOS）上游引物:5′-GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC-3′,下游引物为5′-TACTCGAAACGCCAGTCCTTCTTCTTCGAATGG-3′；③β-actin上游引物:5′-CAGCCGCCACCATTTCGCCA-3′,下游引物:5′-CAGGTCCCGGCCAGCCAGGT-3′。iNOS、cNOS、β-actin 的PCR特异性条带分别为450 bp、661 bp、534 bp。结果用Molcular analyst软件包进行容积定量分析。（4）细胞凋亡分析及增殖细胞核抗原（PCNA）检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞，凋亡试剂盒由德国Bochringer nannheim公司生产。 用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAKO公司。
3.统计学处理：采用t检验或校正t′检验以及线性相关分析。
二、结果
1.Hp感染时胃黏膜组织NO2-水平及NOS基因表达：见表1。
表1 Hp感染者胃黏膜组织NO2水平及NOS基因表达(x±s)
| 组别 |
例数 |
胃炎积分 |
NO2-(μg/g) |
iNOS/actin |
cNOS/actin |
| 对照组 |
8 |
|
4.78±1.63 |
|
0.340±0.171 |
| Hp(+) |
16 |
6.7±2.2 |
246.74±48.25## |
0.812±0.248 |
0.415±0.216* |
| Hp(-) |
12 |
5.8±2.0△ |
64.56±21.40** |
0.344±0.140** |
0.321±0.527△ |
注：**与Hp（+）组比较，##与对照组比较，P值均＜0.01；△与Hp（+）组比较，P＞0.05；与对照组比较，P＞0.05 2.Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化：见表2。
表2 Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化（%，x±s）
| 组别 |
例数 |
凋亡指数 |
PCNA指数 |
| Hp（-） |
12 |
4.26±1.54 |
8.82±2.76 |
| Hp（+） |
16 |
12.48±4.51* |
20.21±4.79* |
注：*与Hp（-）组比较，P＜0.01 3.根除Hp后胃黏膜组织内iNOS mRNA表达、NO2-水平及细胞凋亡指数变化：见表3。iNOS mRNA表达水平和NO2-水平分别与细胞凋亡指数变化呈正相关，r=0.734和0.902， P＜0.05。
表3 根除Hp前后组织内iNOS mRNA表达、
nO2水平及细胞凋亡变化（10例）
| 检测指标 |
根除前 |
根除后 |
| 凋亡指数(%，x±s) |
14.26±6.23 |
3.16±1.67* |
| iNOS/actin |
0.75±0.16 |
0.40±0.11* |
| NO2水平（μg/g） |
269.13±37.84 |
89.42±21.39* |
注：*与根除前比较，P＜0.01 讨论 NOS是NO产生的限速因素，影响NO的生成量和生物效应。NOS分cNOS和iNOS2大类。这些不同型NOS基因的定位结构、表达蛋白质和作用也不尽相同［2］。通常生理浓度NO（pmol或fmol水平）参与信息传递和细胞保护作用。而过量的NO（nmol水平）见于病理刺激和炎症反应时，iNOS mRNA过表达，持久产生大量NO、羟自由基和亚硝酸盐等，引起DNA链断裂、基因突变甚至致癌［4］。
本研究结果证实，正常人胃黏膜组织内仅cNOS mRNA低表达，产生少量NO，而iNOS mRNA未检测到表达。说明在正常生理条件下，低浓度NO主要来源于cNOS，可能与胃黏膜的生理功能及其黏膜防御有关。当Hp感染时，iNOS mRNA表达水平及NO水平显著升高，根除Hp后，上述指标恢复，与治疗前比较差异有显著性（P＜0.01)。该结果提示NO可能参于Hp感染引起胃黏膜损伤的过程［2］。
胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖的不平衡是胃肿瘤发生的重要病理基础［5］。我们发现Hp感染时胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖指数均增加明显，与Hp阴性组比较差异有显著性。根除Hp后，细胞凋亡指数降低，同时iNOS mRNA表达和NO2-水平也显著降低。细胞凋亡指数与iNOS mRNA表达和NO2-水平呈正相关（r=0.734和0.902，P＜0.05)。说明Hp感染时，产生过量NO与胃黏膜细胞凋亡增加有关，特别是腺上皮细胞凋亡，导致腺体的萎缩，酸和胃蛋白酶分泌减少，则有利于亚硝胺类致癌物形成和重要胃癌前病变的发生和发展［1,5］。考虑到Hp感染引起胃黏膜炎症反应常呈慢性持续状态，因此胃黏膜内NO持续大量生成，其在Hp相关性胃病发病中的作用应不宜忽视。
作者单位：李子俊(510080广州，广东省人民医院消化内科)
陈颜芳(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
林秋雄(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
王启仪(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
詹德娟(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
符永恒(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
刘婉薇(510080 广州，广东省人民医院消化内科)
参考文献
1，Ohshima H， Bartsch H. Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of nitric oxide in carcinogensis. Mutat Res , 1994,305: 253-264.
2，Rachmilewitz D, Kameli F, Eliakim R, et al. Enhanced gastric nitric oxide synthase activity in duodenal ulcer patients. Gut,1994,35:1394-1397.
3，Griess LC, Wanger DA, Glogowski J, et al . Analysis of nitrate nitrite and ［15 N］ nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982,126:131-138.
4，藏梦维，刘景生.一氧化氮的致突变性和致癌性.国外医学生理病理科学与临床分册,1998，18（1）: 37-40.
5，Hahm KB, LEE KT, Kim JH, et al. Helicobacter pylori infection, oxidative dNA damage, gastric carcinogenesis, and reversibility by rebamipide. Dig Dis sci,1998,43 (9 Suppl):72S-77S.
用户登录 
新用户注册