一氧化氮、内皮素和循环内皮细胞在支气管哮喘中的作用研究
中国病理生理杂志 1999年第4期第15卷 论著
作者：蒋东波 李华强 史源 潘捷 沈际皋 杨映波 冯素珍 李天星 徐有奇
单位：第三军医大学附属大坪医院，野战外科研究所(重庆 400042)
关键词：哮喘；一氧化氮；内皮缩血管肽类；内皮；细胞；儿童；豚鼠
摘 要 目的：探讨一氧化氮、内皮素和循环内皮细胞在支气管哮喘中的作用。方法：哮喘患儿61例，40名健康儿童为对照，测定其血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP和循环内皮细胞(CEC)水平，用过敏性哮喘豚鼠进行验证。结果：哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、cGMP和CEC水平均明显升高(P＜0.05～0.01)，其中重度哮喘患儿血浆NO-2/NO-3和CEC水平较轻中度哮喘患儿更高(P均＜0.01)；重度哮喘患儿血浆ET水平明显升高(P＜0.01)；哮喘患儿血浆NO-2/NO-3与cGMP和CEC水平呈显著正相关(P＜0.05～0.01)。过敏性哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET及cGMP水平均明显升高(P均＜0.01)；血浆中cGMP和CEC水平亦升高(P均＜0.05)；糖皮质激素可降低NO-2/NO-3、ET、cGMP和CEC水平。结论：哮喘时NO-2/NO-3、ET和CEC产生过多，它们在哮喘发病机制中占有重要地位，而且血浆ET和CEC水平可能与哮喘病情相关。
Roles of NO, ET and CEC in the pathogenesis of asthma
JIANG Dong-Bo, LI Hua-Qiang, SHI Yuan, PAN Jie, SHEN Ji-Gao,
YANG Ying-Bo, FENG Su-Zhen, LI Tian-Xing, XU You-Qi
Daping Hospital, and the Institute of Surgery. Third Military Medical College, Chongqing(400042)
Abstract AIM:To investigate the roles of NO,endothelin(ET) and circulating endothelial cells (CEC) in the pathogenesis of asthma.METHODS：Plasma nitrite and nitrate (NO-2/NO-3), ET, cGMP and CEC levels in 61 asthmatic children and 40 matched normal children were examined. In addition, the plasma and bronchoalveolar lavege fluid (BALF) NO-2/NO-3, ET, cGMP and CEC levels in guinea-pigs with allergic asthma were determined.RESULTS：Asthmatic children had increased amounts of NO-2/NO-3, cGMP and CEC compared with normal control subjects (P＜0.05, P＜0.01).Among them, 15 severe asthmatic children had significantly higher levels of ET than normal subjects (P＜0.01). Elevations of NO-2/NO-3 were correlated with cGMP and CEC(P＜0.05,P＜0.01). Guinea-pigs with allergic asthma had increased amounts of NO-2/NO-3,ET and cGMP in BALF than normal control subjects (P＜0.01),so did cGMP and CEC in plasms(P＜0.05). Glucocorticoid may have reduced NO-2/NO-3, ET, cGMP and CEC contents and even have therapeutic effects.CONCLUSIONS：There were increased production of NO-2/NO-3, ET, and CEC in asthma, they may play an important roles in the pathogenesis of asthma. ET and CEC may be useful in forecasting the severity of illness.
MeSH Asthma; Nitric oxide; Endothelins; Endothelium; Cells; Child;Guinea-pigs
肺脏能释放内皮依赖性舒张因子(endothelium derived relaxing factor, EDRF)及内皮依赖性收缩因子(endothelium derived contracting factor,EDCF)，二者的动态平衡对于维持正常的气道张力及肺血管张力非常重要。目前已知：一氧化氮(nitric oxide, NO)是EDRF的主要活性成分，而内皮素(endothelin, ET)是EDCF的主要活性成分之一。NO具有血管及支气管舒张作用［1］，ET是强烈的血管及支气管收缩剂［2］。故我们推测NO及ET在支气管哮喘中可能具有重要的发病学意义。本文旨在测定正常儿童，支气管哮喘患儿血浆NO、ET、cGMP及循环内皮细胞(circulating endothelial cells, CEC)水平，并在动物模型上进行验证，探讨NO及ET在哮喘发病机理中的作用。
对象和方法
一、研究对象及分组处理：
(一)临床研究：
1.对照组：健康儿童共40名，2～10岁(平均4.6岁)，其中男22名，女18名。均无哮喘病史，采血前4周内无感染及用药史。
2.哮喘组：确诊为支气管哮喘的本院住院患儿，均为急性发作期病人，轻中度哮喘46例，重度哮喘(哮喘持续状态)15例，共61例，其中男37例，女24例，年龄1～12岁(平均4.9岁)。住院次晨采外周静脉血样待测。
(二)动物实验研究：
体重为200～250 g健康幼年豚鼠24只 ，雌雄各半，随机分为3组，每组8只。
1.哮喘组：用10%卵白蛋白腹腔注射1.0mL致敏动物，2周后用1%卵白蛋白超声雾化吸入致其哮喘发作，出现喘息，呼吸困难和紫绀等。隔日诱喘1次，共10次，末次后于15min内采心脏血样品并摘取动物肺脏行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)6～7mL，置4℃ 3 000 r/min离心10min后，取上清液待测。
2.哮喘+氢化可的松组：诱喘方法同上，在每次诱喘前腹腔注射氢化可的松0.5mg/100g。
3.对照组：用生理盐水(normal saline, NS)做对照，方法同哮喘组。
二、检测方法：
(一)NO水平测定：NO-2/NO-3是NO的稳定代谢产物，是反映NO产生水平的良好指标。检测其浓度以代表NO水平［3］。
(二)ET及cGMP水平测定：采用特异性放射免疫分析法测定(试剂盒分别由解放军总医院及上海医科大学提供)，按说明书要求操作。
(三)CEC水平测定：见参考文献［4］。
三、统计处理：
结果以均数±标准差(
±s)表示，哮喘患儿组间比较用t检验；动物实验结果行方差分析，组间q检验或t检验作统计处理，并做直线相关分析。
结果
一、轻中度哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：
轻中度哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、cGMP和CEC水平均显著高于正常儿童(P＜0.05～0.01)，而ET水平与健康儿童比较无明显差异(P＞0.05)(见表1)。
二、重度哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：
重度哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平均显著高于正常儿童(P＜0.01)，且NO-2/NO-3、ET及CEC水平明显高于轻中度哮喘患儿(P＜0.01)，而cGMP水平在重度与轻中度哮喘患儿之间比较无明显差异(P＞0.05)(见表1)。
表1 哮喘患儿血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平
Tab 1 Levels of NO-2/NO-3,ET,cGMP and CEC in the plasma of asthmatic children (
±s)
| |
n |
NO-2/NO-3(μmol/L) |
ET(ng/L) |
cGMP(nmol/L) |
CEC(0.9 μL-1) |
| Control |
40 |
29.8±4.6 |
10.2±2.1 |
4.72±0.25 |
5.56±0.20 |
| Mild asthma |
46 |
32.7±5.8* |
10.4±3.1 |
6.23±0.22** |
11.24±1.59** |
| Severe asthma |
15 |
105.1±7.1**▲ |
25.9±3.6**▲ |
6.36±0.23** |
16.87±1.25**▲ |
*P＜0.05, **P＜0.01,vs control； ▲P＜0.01, vs mild asthma
三、哮喘豚鼠血浆NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：
哮喘豚鼠血浆NO-2/NO-3、ET水平与对照组和哮喘+氢化可的松组比较差异均无显著性(P均＞0.05)；哮喘组cGMP水平明显高于对照组(P＜0.05)，哮喘+氢化可的松组cGMP水平同对照组比较差异无显著(P＞0.05)，但明显低于哮喘组(P＜0.05)；哮喘组CEC水平明显高于对照组和哮喘+氢化可的松组(P均＜0.05)，而后二者比较差异无显著性(P＞0.05)(见表2)。
表2 过敏性哮喘豚鼠血浆和支气管肺泡灌洗液中NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平
Tab 2 Levels of NO-2/NO-3,ET, cGMP and CEC in the plasma and BALF(bronchoalveolar lavage fluid) of guingea-pigs with allergic asthma (
±s)
| |
n |
|
NO-2/NO-3(μmol/L) |
ET(ng/L) |
cGMP(nmol/L) |
CEC(0.9 μL-1) |
| Control |
8 |
Plasma
BALF |
22.6±2.7
6.2±0.8 |
1.10±0.21
1.27±0.33 |
2.20±0.04
1.42±0.15 |
2.4±0.8 |
| Asthma |
8 |
Plasma
BALF |
21.6±2.3
10.2±1.3** |
1.26±0.29
5.05±0.59** |
3.54±0.06*
3.09±0.11** |
4.3±1.2* |
| Asthma+
glucocorticoid |
8 |
Plasma
BALF |
21.4±2.8
7.2±1.1▲▲ |
1.14±0.23
2.36±0.27▲▲ |
2.18±0.04▲
1.50±0.09▲▲ |
2.5±0.9▲ |
★P＜0.05,★★P＜0.01, vs control; ▲P＜0.05,▲▲P＜0.01, vs asthma
四、哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)NO-2/NO-3、ET和cGMP水平：
哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET和cGMP水平明显高于对照组(P均＜0.01)和哮喘+氢化可的松组(P均＜0.01)，而后二者比较差异无显著(P均＞0.05)(见表2)。
五、直线相关分析：
哮喘患儿血浆NO-2/NO-3与cGMP及CEC水平呈显著正相关(r分别为0.401；0.391，P分别＜0.01，＜0.05)；而NO-2/NO-3与ET水平之间无显著相关(r=0.043,P＞0.05)。哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3水平与cGMP呈显著正相关(r=0.862,P＜0.01)；BALF中NO-2/NO-3水平与CEC水平亦呈显著正相关(r=0.796,P＜0.05)；NO-2/NO-3与ET水平无显著相关(r=0.516,P＞0.05)。
Hamid等［5］报道哮喘气道诱导型一氧化氮合酶(iNOS)增多，功能活跃，推测哮喘时NO产生应增多，但目前未见类似报道。仅Kharitonov等［6］发现哮喘患者呼出的NO增加。本实验观察到哮喘患儿血浆NO-2/NO-3水平升高；过敏性哮喘豚鼠BALF中水平亦显著升高。越来越多的证据表明NO是非肾上腺素能非胆碱能神经(NANC)的递质之一。气道神经中NO释放数量增多对哮喘患者可能是有益的，但气道神经释放的NO是由结构型一氧化氮合酶(cNOS)合成的，而在哮喘时cNOS可能存在功能上的缺陷［7］。iNOS在细胞因子等诱导下可产生大量NO。NO在哮喘时升高的机制尚不清楚，可能与巨噬细胞激活，炎症刺激及细胞因子释放有关。NO的过多生成对机体是有害的，它可引起哮喘患者气道充血，加重血浆渗漏，造成肺上皮细胞及组织损伤，引起气道高反应性(AHR)［7］而导致或(和)加重哮喘。
本研究还发现轻中度哮喘患儿血浆ET水平无明显变化，而重度哮喘患儿则明显升高，且过敏性哮喘豚鼠BALF中也明显升高。其原因可能有：(一)肺脏是体内循环ET清除和代谢的主要器官，在轻中度哮喘时能及时清除多余的ET，而在重度哮喘时肺组织生成和释放ET增多，但清除ET减少；(二)重度哮喘时机体极度缺血、缺氧、CO2潴留可促进全身血管内皮细胞等产生大量的ET［8］。ET乃是机体在严重缺血、缺氧状态下产生的一种内源性致伤因子，从而加重机体的缺血、缺氧，导致恶性循环，甚至哮喘性呼吸衰竭。故血浆ET水平可作为判断哮喘病情的一项生化指标。
本研究还发现CEC水平在哮喘患儿及过敏性哮喘豚鼠均显著升高。CEC水平是目前活体内唯一可以特异而直接反映血管内皮细胞损伤的指标［4］。说明哮喘时存在血管内皮细胞的损伤、脱落。我们发现CEC水平与NO-2/NO-3水平呈显著正相关。说明NO在哮喘血管内皮细胞损伤中可能起一定作用。重度哮喘患儿CEC水平明显高于轻中度哮喘患儿，说明CEC水平同病情可能相关。另外NO可导致cGMP升高，哮喘时cGMP的升高可导致肥大细胞脱颗粒，释放大量递质而致哮喘发作。
本实验还发现哮喘+氢化可的松组豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET、cGMP和血浆cGMP、CEC水平明显低于哮喘组，与对照组无显著差异。说明氢化可的松可抑制哮喘时NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC的产生。其机制可能在于：抑制iNOS的生成及活性(cNOS无作用)；抑制ET mRNA的基因转录，且对ET活性有直接抑制作用［8］。
参考文献
1 Belvisi MG, Stretton CD, Barnes PJ. Nitric oxide is the endogenous neurotransmitter of bronchodilator nerves in human airway. Eur J Pharm, 1992,210:221.
2 Uchida Y, Ninomiya H, Saotome M, et al. Endothelin, a novel vasoconstrictor peptide, as potent bronchoconstrictor. Eur J Pharm, 1988, 154:227.
3 Shi Y, Shen JG, Wang JH, et al. Plasma nitric oxide levels in newborn infants with sepsis. J Pediatr, 1993, 123:435.
4 杨映波，王正国，朱佩芳，等.血循环中内皮细胞数量变化意义的初探.第三军医大学学报，1990，12：209.
5 Hamid Q, Springall DR, Rieros-Moreno V, et al. Induction of nitric oxide synthase in asthma. Lancet, 1993, 342:1510.
6 Kharitonov SA, Yates D, Robbins RA, et al. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet, 1994, 343:133.
7 Barnes PJ. Nitric oxide and airways. Eur Respir J, 1993,6:163.
8 蒋东波，沈际皋，李华强，等.小儿哮喘与内皮素-1关系的初步研究.临床儿科杂志，1995，1：22.
1997年9月29日稿，1998年3月31日修回
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