Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体基因A1166C多态性与糖尿病合并冠心病的关系

中华内分泌代谢杂志 2000年第4期第16卷 论著

作者：高凌　甘佩珍　李竞　鞠海兵　周蕾燕

单位：高凌（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院内分泌科）；甘佩珍（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院内分泌科）；李竞（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院内分泌科）；鞠海兵（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院内分泌科）；周蕾燕（430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院内分泌科）

　　关键词： 糖尿病，非胰岛素依赖型；冠状动脉疾病；受体，血管紧张素；多态性，限制性片段长度

　　【摘要】　目的　血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体(Ⅰ型ATR)基因A1166C多态性与2型糖尿病及合并冠心病的关系。方法　用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法探查Ⅰ型ATR基因A1166C多态性在正常对照组、单纯2型糖尿病组、2型糖尿病合并冠心病组中的基因频率分布。结果　2型糖尿病合并冠心病组Ⅰ型ATR的C等位基因频率　明显高于正常对照组(χ²=6.02，P＜0.05)和单纯2型糖尿病组(χ²=5.71，P＜0.05)，且与甘油三酯和脂蛋白(a)相关(分别r=0.143，P＜0.05；r=0.215，P＜0.01)。结论　携带C等位基因的2型糖尿病患者比携带A等位基因更易罹患冠心病，并在一定程度上与血脂代谢相关联。

Relationship between angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor gene A1166C polymorphism and diabetes complicated with coronary heart disease

GAO Ling

　　(Endocrinology Division,The First Hospital Affiliated to Hubei Medical University,Wuhan 430060)

　　GAN Peizhen

　　(Endocrinology Division,The First Hospital Affiliated to Hubei Medical University,Wuhan 430060)

　　LI Jing,et al.

　　(Endocrinology Division,The First Hospital Affiliated to Hubei Medical University,Wuhan 430060)

　　【Abstract】　Objective　To determine whether the angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor (type Ⅰ ATR) gene A1166C polymorphism is associated with coronary heart disease (CHD) in type 2 diabetic patients.Methods　To investigate the allele frequency and the genotype distribution of the type Ⅰ ATR gene A1166C polymorphism in the group of normal control, simple diabetes, diabetic CHD by means of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).Results The group of diabetic CHD had a higher frequency of C allele of the type Ⅰ ATR gene A1166C polymorphism than those of normal control (χ²=6.02, P＜0.05) and diabetes (χ²=5.71, P＜0.05), and the C allele is also correlated with higher triglyceride and lipoprotein (a) (r=0.143, P＜0.05； r=0.215, P＜0.01 respectively).Conclusion The patients of diabetes mellitus with type Ⅰ ATR C allele were more susceptible to coronary heart disease than the patients of diabetes mellitus with A allele, which is associated, at least to some extent, with lipid metabolism.

　　【Key words】　Diabetes mellitus, non-insulin-dependent; Coronary disease; Receptors, angiotensin; Polymorphism, restriction fragment length

(Chin J Endocrinol Metab, 2000,16:216-219)

　　血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮(RAA)系统的重要激素。Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(Ⅰ型ATR)介导了AngⅡ的主要心血管效应，而糖尿病与冠心病可能存在共同的遗传基础，因此Ⅰ型ATR基因不仅一直是心血管疾病的重要候选基因，也是糖尿病遗传研究的热点。为了揭示Ⅰ型ATR变异与中国人2型糖尿病及2型糖尿病合并冠心病的相关性并进一步探讨其共同发病机制，我们运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析了Ⅰ型ATR A1166C基因多态性在正常对照组、2型糖尿病及2型糖尿病合并冠心病的分布频率。

　　对象和方法

　　一、对象

　　正常对照组为体检健康者73例，年龄(56.1±12.4)岁，排除糖尿病、肾脏疾病和心血管疾病。

　　选取我院2型糖尿病住院患者123例，其中单纯2型糖尿病患者(DM组)(排除心血管合并症)80例，2型糖尿病合并冠心病(DM合并CHD组)患者43例。糖尿病诊断均按1985年WHO标准。

　　二、方法

　　1.试剂:dNTPs和Taq DNA聚合酶由上海Promega公司提供，DNA片段长度标志物(pBR322 DNA/Msp I markers)为华美生物公司产品；限制性核酸内切酶Dde I由美国Promega公司提供。

　　2.引物的设计与合成：引物参照Doria等^〔1〕的设计，由美国Gibco公司合成。PCR引物序列为5'-CACCATGTTTTGAGGTTA-3'及5'-CGAGTT-TCTGACATTGTTC-3'。

　　3.Ⅰ型ATR基因A1166C多态性的检测：(1)用NaI法提取外周血白细胞DNA；(2)目的基因的扩增PCR步骤：95℃预变性10分钟，94℃变性45秒，61℃退火45秒，72℃延伸45秒，总共循环30次，72℃终末循环10分钟，最后置于4℃终止反应。扩增产物为3'非翻译区的5'末端274 bp的DNA；(3)PCR产物用限制性内切酶Dde I于37℃消化4～6小时；(4)将限制性酶切产物5 μl以10%非变性聚丙烯酰胺凝胶于150V电泳1小时分离酶解片段，溴乙锭染色10分钟后紫外灯下鉴定基因型，A等位基因为274 bp，C等位基因165 bp及109 bp两个片段。只有一条274 bp片段的为AA基因型，含有165 bp和109 bp两条片段的为CC基因型，含有以上三条片段的为AC杂合基因型。

　　4.临床及实验室检查：测量受检者的身高和体重，根据BMI=体重/身高²(kg/m²)计算体重指数。并测定血脂、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、糖基化血红蛋白(HbA_1c)。血糖用氧化酶法，糖基化血红蛋白采用微柱层析法，胰岛素的测定采用放射免疫法，胰岛素敏感指数(ISI)：ISI=-ln(FINS×FPG)：受检者均于采血前15天停用影响脂代谢的药物和食物，甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)在半自动生化仪上检测，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用Friedewald公式求出。

　　三、统计学处理

　　数据以±s表示，计数资料采用t检验和χ²检验、相关与Logistic回归使用SPSS软件包进行分析。

　　结　　果

　　一、各组间临床和生化特征比较

　　表1示各组临床和生化检测所获的资料。三组间患者年龄和性别差异无显著性，具有可比性。糖尿病组与对照组比较：空腹血糖、　　LDL、　　TC、TG、Lp(a)均高于对照组，空腹胰岛素、胰岛素敏感指数、HDL均低于对照组，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；合并冠心病组与对照组LDL、Lp(a)、TC、TG、空腹血糖、舒张压及收缩压均高于对照组，胰岛素敏感指数及HDL均　低于对照组差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；合并冠心病组的apo A、Lp(a)、空腹胰岛素水平、收缩压、舒张压均高于单纯DM组差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

表1　各组的临床资料和生化特征(±s)

　　Tab 1　Clinical and laboratory data of diabetic and control subjects (±s)

　　注：BMI:Body mass index; apo:Apolipoprotein; Lp(a):Lipoprotein (a); HDL:High density lipoprotein; LDL:Low density lipoprotein; TG:Triglyceride; TC:Total cholesterol; FPG:Fasting plasma glucose; FINS:Fasting insulin; ISI:Insulin sensitivity index; SBP:Systolic blood pressure; DBP:Diastolic　　blood　　pressure;与　正常对照组比　较 vs　　control　　group,^*P＜0.05,^**P＜0.01；与　糖尿病组比　较 vs diabetes group,^△P＜0.05,^△△P＜0.01

表2　各组基因频率和基因型分布

Tab 2　Distribution of genotypes and allele frequency

　　注：与正常对照组比较 vs control group,^*P＜0.05； 与糖尿病组比较 vs diabetes group,^△P＜0.05　　二、各组基因频率分布

　　表2显示正常对照组与糖尿病患者Ⅰ型ATR基因的各种等位基因型的分布情况。三组对象基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。A1166和1166C在对照组、糖尿病组和合并冠心病组的等位基因频率分别为96.6%和3.4%，96.3%和3.7%，88.4%和11.6%。合并冠心病组和对照组(χ²=6.02,P＜0.05)和糖尿病组的等位基因频率差异有显著性(χ²=5.71,P＜0.05)。合并冠心病组中14例高血压患者与该组中正常血压患者、合并组之间两两比较等位基因频率差异无显著性(P＞0.05)。

　　三、相关分析与Logistic回归分析

　　各组内Ⅰ型ATR基因A1166C多态性与各发病因素间的单因素相关分析表明，糖尿病组中Ⅰ型ATR C等位基因与FINS和TG呈正相关(分别r=0.429,P＜0.01;r=0.255,P＜0.05)；合并冠心病组中Ⅰ型ATR C等位基因与Lp(a)和TG呈正相关(分别r=0.143,P＜0.05；r=0.215,P＜0.01)，而与其他临床和生化指标无相关性。风险因素独立性分析，有显著差异的变量为Ⅰ型ATR基因型、HDL、LDL、Lp(a)、TC和ISI；以有显著性差异的变量为自变量，CHD为分类变量进行Logistic回归分析，经逐步选择表明Ⅰ型ATR基因型、TC为独立变异危险因素。糖尿病人AC基因型与AA型相比对冠心病的比数比(OR)为4.41(95%CI:0.75～28.71)，用Logistic回归校正后，OR为2.48(95%CI 1.04-5.89,P＜0.05)。

　　讨　　论

　　RAA系统是人体内维持水电解质平衡及血压的重要内分泌系统之一，AngⅡ受体主要分为2型：Ⅰ型ATR和Ⅱ型ATR。Ⅰ型ATR介导了AngⅡ的几乎所有的心血管效应。

　　糖尿病存在一定程度的脂代谢紊乱且其发病与遗传有关。我们的研究并未发现Ⅰ型ATR基因型分布在糖尿病组与对照组间存在差异。相关分析仅发现糖尿病组Ⅰ型ATR 1166C等位基因与血浆TG和FINS浓度呈正相关，而并未发现Ⅰ型ATR基因型与BMI、ISI、HbA_1c和其他血脂指标的相关性，提示糖尿病患者的Ⅰ型ATR C等位基因可加重脂代谢紊乱，但并未直接参与糖尿病的发病。

　　自从Bonnardeaux等^〔2〕1994年运用单链构像多态性(SSCP)和寡链核苷酸探针(ASO)杂交技术发现白种人Ⅰ型ATR基因中A1166C突变与高血压相关以后，又有许多文献报道了该突变与高血压(中国人)、冠心病(法国人^〔3，4〕、日本人^〔5〕、中国人^〔6〕)相关联。但仍有许多不一致的报道。本研究显示合并　冠心病组与对照组在等位基因　频率、HDL、LDL、Lp(a)、FPG、FINS、ISI、TC、TG、舒张压和收缩压差异有显著性，合并冠心病组与单纯糖尿病组apoA、FPG、FINS、ISI、Lp(a)、舒张压、收缩压和等位基因频率差异也有显著性，提示以上因素可能是糖尿病合并冠心病的危险因素。合并冠心病组中高血压患者与正常血压患者的等位基因频率差异无显著性，而合并冠心病组中C等位基因频率明显高于糖尿病组和对照组；Ⅰ型ATR基因型与各因素间的单因素相关分析表明，合并冠心病组中AC基因型与Lp(a)和TG呈正相关而与血压无关；风险因素独立性分析表明AC基因型及TC为2型糖尿病合并冠心病独立变异危险因素。据此我们认为1166C等位基因是2型　糖尿病患者罹患冠心病　的独立危险因素，他可能通过某种机制升高LDL、Lp(a)、TG、降低HDL影响这些中间状态来参与2型糖尿病患者冠心病的发病，而与是否患高血压无关。Jones等人^〔7〕的研究也提示Ⅰ型ATR基因多态性可通过AngⅡ调节脂肪细胞内的脂质合成和储存来影响血脂。因此，本结论与多数研究基本一致^〔8〕，但仍需多中心、大样本的研究以证实。通过检测基因型来筛查糖尿病患者中的高危人群，对早期发现和及时防治冠心病等严重合并症具有重要的意义。

　　 参考文献

　　1，Doria A, Ji L, Warram JH, et al. Dde I polymorphism in the AGTR1 gene. Hum Mol Genet, 1994,31:1444-1448.

　　2，Bonnardeaux A, Dovies E, Jeunemaitre X, et al. Angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor gene polymorphism in human essential hypertension. Hypertension, 1994,24:63-69.

　　3，Jeunemait X, Ledru E, Battaglia S, et al. Genetic polymorphism of the renin angiotensin system and angiographic extent and severity of coronary artery disease. Human Genet, 1997,99:66-73.

　　4，Tiret L, Bonnardeux A, Poirier O, et al. Synergistic effects of angiotensin-converty enzyme and angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor gene polymorphism on risk of myocardia infarction. Lancet, 1994,344:910-913.

　　5，Nakachi Y, Suehiro TA, Yamanoto M, et al. Significance of angiotensin I converting enzyme and angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor polymorphisms as risk factors for coronary heart disease. Atheroscler, 1996,125:161-169.

　　6，项坤三， 郑泰山， 孙多奇， 等. Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体基因与中国人冠心病、高血压及糖尿病的关系. 中华医学遗传学杂志， 1998,15:9-12.

　　7，Jones BH, Standridge MK, Moustaid N. Angiotensin Ⅱ increases lipogenesis in 3T3-L1 and human adipose cells. Endocrinology, 1997,138:1512-1519.

　　8，高凌， 甘佩珍. 血管紧张素Ⅱ受体研究概况. 国外医学遗传学分册， 1999，22：157-160.

(收稿日期：1999-05-04)