超声损伤卵巢癌细胞线粒体的体视学研究

中国超声医学杂志 2000年第4期第16卷 基础研究

作者：于廷和　彭明利　王智彪

单位：于廷和　王智彪(400046　重庆医科大学医学超声工程研究所)；彭明利(肝炎研究所)；于廷和(山东医科大学附属医院)

　　关键词： 超声；卵巢癌细胞；线粒体；体视学

　　摘　要　目的：研究超声辐照后受损伤卵巢癌细胞线粒体体视学参数的变化。方法：观察超声辐照后细胞超微结构的变化。测量并计算受损伤细胞和对照细胞线粒体的体密度、表面积密度、表面积体积比、平均体积、数密度和平均表面积。结果：超声辐照后部分细胞形态学变化不明显，部分细胞线粒体肿胀、嵴断裂。与对照细胞相比，受损伤细胞线粒体平均体积增大(P＜0.005)，平均表面积增大(P＜0.05)，体密度、表面积密度增大(P＜0.005，P＜0.005)，表面积体积比减小(P＜0.01)，数密度无明显改变(P＞0.05)。结论：超声辐照可损伤卵巢癌细胞线粒体，受损细胞线粒体肿胀其体积增大较表面积增大明显。

A Stereological Study on the Mitochondria in Ovarian Carcinoma Cells Damaged by Ultrasound

Yu Tinghe,Peng Mingli,Wang Zhibiao

　　Institute of Ultrasound Engineering in Medicine,Chongqing Medical University　Chongqing　400016

　　ABSTRACT　Objective:To determine the stereological parameters of the mitochondria of ovarian carcinoma cells damaged by ultrasound.Methods：The ultrastructures of the tumor cells exposured to ultrasound were inspected,namely the volume density,average volume,surface density,average surface area,specific surface and numerical density of mitochondria of the cells damaged as well as the normal control were measured,calculated and compared.Results:Swollen mitochondria with fractured ridges appeared in some of the irradiated cells.The volume density,average volume,surface density,average surface area of the damaged cells were increased(P＜0.05，P＜0.005，P＜0.005，P＜0.05)；the specific surface decreased(P＜0.01)and the numerical density not significantly affected(P＞0.05).Conclusion:Mitochondria of ovarian carcinoma cells were damaged by ultrasound;the enlargement of mitochondria volume was more than that of surface area.

　　KEY WORDS　Ultrasound　Ovarian carcinoma cell　Mitochondria　Stereology

　　未致细胞急性死亡的低强度超声对卵巢癌细胞3AO超微结构改变轻微，但可通过空化效应致部分细胞线粒体损伤，表现为肿胀，嵴断裂^〔1〕。本文拟从形态计量学角度研究超声辐照后受损伤细胞的线粒体变化，以期进一步阐明其在肿瘤治疗中的意义。

　　资料与方法

　　1、细胞　3AO细胞以RPMI 1640(GIBCO)培养基培养，培养液含10%新生小牛血清，100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。培养条件为5%CO₂、37℃。

　　2、超声辐照　超声波系统及超声辐照均参照以往实验^〔1〕，对照组细胞予以假照。

　　3、超微结构和线粒体体视学参数　超声辐照及对照细胞以戊二醛、锇酸固定，环氧树脂包埋，超薄切片，铀/铅染色，透射电镜(H-600 HITACHI)观察。超声辐照组中选择有超微结构改变细胞观察、拍照。用网格测试系统以点计数法测量并计算线粒体体密度(Vv)、平均体积(,μm³)、表面积密度(Sv,μm^－1)、表面积体积比(Rsv,μm^－1)、数密度(Nv,μm^－3和平均表面积(，μm²)^〔2，3〕。

　　4、超微结构，统计处理　t检验，P＜0.05为显著性。

　　结　　果

　　1、超微结构超声辐照后部分细胞形态学变化不明显，部分细胞线粒体肿胀、嵴断裂(图1～3)。

　　2、线粒体体视学与经假照细胞相比，受辐照损伤细胞Vv、Sv、、均增大，Rsv减小，Nv无明显改变(表1)。

　　讨　　论

　　线粒体对各种因素的反应敏感，其体积、面积和数量均可因影响因素而改变，且往往较其他形态学改变出现早^〔4〕。本研究发现，未致3AO细胞急性死亡的低强度超声即可致部分细胞线粒体增大，体密度和表面积密度增加，平均体积和平均表面积分别为对照2.12倍和1.68倍。这与超微结构的线粒体肿胀是一致的^〔1〕。

图1　受假照细胞×10000

图2　超声辐照后，细胞超微结构变化不明显×12000

图3　超声辐照后，线粒体肿胀，嵴断裂×12000

　　线粒体是细胞内ATP产生的场所，其状况直接影响细胞的生存力。对神经组织的研究发现，缺血造成神经细胞损伤时，线粒体肿胀，体视学参数中体密度、平均直径增大，比表面、数密度减小，而在给予有效干预措施后，线粒体肿胀减轻，体视学参数也发生相应改变^〔5〕。神经组织对超声的反应性与肿瘤组织相类似，都较敏感。线粒体明显肿胀，即其平均体积、体密度、表面积密度、平均表面积均明显增加时，线粒体的损伤不可逆，进而影响细胞成活。如果这种损伤发生在干细胞，则将影响细胞的增殖能力和克隆行成能力，从超声生物学效应角度考虑，这反映为超声的迟发性抑制。

表1　超声辐照后细胞线粒体的体视学参数

　　注：*P＜0.005　**P＜0.01　ΔP＜0.05　ΔΔP＞0.05　　考察肿瘤细胞的变化，不应仅局限于细胞，而应从肿瘤水平分析。线粒体体视学参数变化分析同样应有整体观念，结合肿瘤生物学特性、线粒体损伤细胞在肿瘤组织中所占比例、单个细胞内线粒体损伤的比例及受损线粒体功能受影响的程度而综合分析对肿瘤的影响。缺血损伤时，可从多个角度起作用，在本研究中，反映单位参照系内线粒体数量的数密度Nv在辐照后受损伤的细胞中并无变化，提示低强度超声影响卵巢癌主要是从影响线粒体的功能而起作用。

　　线粒体损伤的原因可能源于空化^〔1〕，超声损伤细胞组织主要归结于惯性空化(inertial cavitation)^〔6〕。空化时瞬间局部温度可达5000K以上^〔7〕。这足以导致生物活性基团产生而对细胞组织产生影响，致结构和/或功能变化，当超声用于肿瘤治疗时，则需合理地控制超声辐照，使这种改变有利于治疗和预后。线粒体明显损伤时，其呼吸链酶的活性必然受到影响，由于肿瘤组织对糖的利用与正常组织有异，其无氧酵解增强，故为精确评价线粒体体视学参数改变对肿瘤细胞存活的影响，尚需结合对无氧呼吸的影响而综合分析，确定其存活力受影响的程度。从理论上讲，空化产生的活性基团同样能影响无氧呼吸酶。

　　受超声辐照后有线粒体损伤的细胞，其线粒体Rsv减小，提示低强度超声致卵巢癌细胞线粒体肿胀时，其体积增大较表面积增大明显，这使其在低渗时更易溶解，而随体积增大，膜破裂所需剪切力减小^〔6〕，即其易受损性增加，这对肿瘤治疗而言，是极为有利的。

　　“九五”国家重点科技攻关资助(96-905-02-01)

　　参考文献

　　1，于廷和，王国云，蔡汉钟，等.非致死剂量超声对卵巢癌细胞超微结构的影响.中国超声医学杂志，1999，15，647～648

　　2，汪　濂主编.现代医学实验方法.北京，人民卫生出版社，1997，51～67

　　3，赵卫华，王自能，申　洪，等.胎儿输卵管上皮细胞线粒体的体视学研究.中国体视学与图像分析，1998，3：84～87

　　4，Murray MK,Epithelial lining of the sheep ampulla oviduct undergoes pregnancy associated morphological changes in secretory status and cell height.Biol Reprod,1995,53:653～663

　　5，罗　勇，黄仲荪，徐　晨.针刺对缺血性梗塞大鼠皮层神经元线粒体影响的形态计量研究.上海针灸杂志，1996，15(6)：28～30

　　6，Miller MW,Miller DL,Brayman AA.A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective.Ultrasound Med Biol,1996,22:1131～1154

　　7，Flint EB,Suslick KS.The temperature of cavitation.Science,1991,253:1397～1399

(1999-09-09收稿,220天刊出)