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生长抑制DNA损伤基因45与p53对卵巢癌细胞凋亡作用的研究

生长抑制DNA损伤基因45与p53对卵巢癌细胞凋亡作用的研究

现代妇产科进展 1999年第1期第8卷 述评

作者:周志春 冯捷 钱和年 崔恒 傅天云 叶雪

单位:北京医科大学民医院妇科肿瘤研究中心,100034

关键词:生长抑制DNA损伤基因45;p53;卵巢肿瘤;细胞凋亡

  摘要 目的:研究生长抑制DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage,GADD)对卵巢癌细胞的作用及与p53蛋白表达的关系。方法:利用RT-PCR鉴定卵巢癌SKOV3和3AO细胞株GADD45的表达;采用RT-PCR和Western Blot鉴定SKOV3和3AO细胞株p53蛋白的表达。通过载体构建将目的基因GADD45重组于pcDNA-Ⅲ真核质粒内。利用脂质体(DOTAP)法转染SKOV3和3AO细胞株;G418抗性筛选,RT-PCR进行表达鉴定。采用流式细胞仪分析(FCM)以及DNA梯度法对细胞凋亡现象进行检测。结果:卵巢癌SKOV3和3AO细胞株GADD45表达阴性。SKOV3细胞株p53蛋白表达阳性;3AO细胞株p53蛋白表达阴性。转染GADD45基因的SKOV3细胞株经化学药物足叶已甙(VP16)和紫外线诱导后,可以使该细胞产生凋亡现象,而对转染GADD45基因的3AO细胞株经诱导后,未见细胞凋亡现象。结论:转染GADD45基因,对p53蛋白表达阳性的细胞株SKOV3经诱导后,可使细胞进入凋亡状态。对p53蛋白表达阴性的细胞株3AO转染GADD45基因后,经诱导细胞无凋亡现象,证实GADD45作用途径可能是通过野生型p53蛋白作用实现的,其细胞凋亡作用依赖于p53蛋白的表达。

  Study of the effects of GADD45 and p53 protein on apoptosis of ovarian carcinoma cell lines

Zhou Zhichun,Feng Jie,Qian Henian,et al.

  Gynecologic Oncology Center,Peoples Hospial of Beijing Medical University,100034

  Abstract Objective:To study the effects of growth arrest and DNA damage(GADD)gene 45 on ovarian cancer cell lines and the relationship between the effect and the expression of p53 protein.Methods:Expressions of GADD45 and p53 protein in ovarian cancer cell liines SKOV3 and 3AO were identified respectively using RT-PCR and Western Blot.A eukaryotic expressing vector encoding GADD45 named pcDNA-GADD45 was constructed and transfected into SKOV3 and 3AO cell lines with lipofectin(DOTAP),then selected by anti-G418.The expression of GADD45 was identified using RT-PCR.Apoptosis was analyzed using FCM and DNA ladder.Results:The expression of GADD45 in ovarian cancer cell lines SKOV3 and 3AO was not detected.There was positive expression of p53 protein in SKOV3 whereas negative expression in 3AO.It was in the SKOV3 transferred GADD45 gene after induction by VP16 and UV-irradiation that the apoptosis was found,but no apoptosis in the 3AO transferred the same gene.Conclusions:The cell line,which has positive expression of p53 protein transferred GADD45 gene shows the apoptosis after induction by VP16 and UV-irradiation.The cell line,however,which has negative expression of p53 protein,couldn t show the apoptosis.The function of GADD45 gene may be dependent on the wild type p53 protein.

  Key words Growth arrest DNA damage45;P53;Ovarian neoplasms;Apoptosis

  GADD基因组是在肿瘤基因治疗研究中涌现出来的,它可在DNA损伤因素的诱导下,发挥使细胞生长抑制和细胞凋亡的作用。卵巢癌(ovarian carcinoma,OC)为妇科肿瘤患者重要的死亡原因。我们就GADD45对p53蛋白不同表达的OC细胞株的作用作了研究,报道如下。

  1 材料与方法

  1.1 细胞株  SKOV3为卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株,购自美国Memorial Sloan-Kettering Cancer Center;3AO为卵巢上皮癌细胞株引自上海中科院细胞库。

  1.2 质粒和菌株  质粒pSK-GADD45(含GADD45全序列1.4kbp)和菌株大肠杆菌DH5-α均系北京医科大学民医院中心实验室王申五老师惠赠。

  1.3 试剂  内切酶、T4连接酶及G418均为Sigma产品,lipofectin(DOTAP)购自Boehringer Mannheim公司;小鼠抗p53单抗系Santa Cruz公司产品,RNA及RT-PCR试剂盒购自同正公司。

  1.4 Western Blot鉴定用于SKOV3和3AO细胞株中p53蛋白的表达。

  1.5 真核重组质粒构建及鉴定  pSK-GADD45经Not-a、Kpn-1双切酶,低熔点琼脂糖电泳回收目的基因GADD45,用T4连接酶将其连接到经相同内切酶酶切的质粒pcDNA-Ⅲ大片段上,构建成重组质粒pcDNA-GADD45,转化大肠杆菌DH5-α,提取质粒进行酶切鉴定。

  1.6 细胞转染  采用lipofectin(DΟΤΑΡ)将pcDNA-GADD45重组质粒和pcDNA-Ⅲ原质粒分别转染SKOV3和3AO细胞株后,于5%CO2、37℃培养箱培养。(前者为实验组,后者为对照组,亲本细胞为空白对照组)。

  1.7 转染细胞的筛选  根据真核质粒有G418抗性,用G418进行筛选培养。从高浓度(600μg/ml)开始,当对照组细胞大部分死亡,G418的浓度降低一半(300μl/ml)时,维持筛选,待长出单克隆后,扩大培养。

  1.8 G418筛选后的细胞鉴定  根据GADD45基因全序列,设计上、下游引物:S:5'-TGTCGTT

  -CTCGCAGCAAA-3' SA:5'-TGGATAAGGTG-GGGGATG-3'。RT-PCR内参引物为(β-actin):S:5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'SA:5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。提取细胞RNA,按试剂盒说明进行RT-PCR,并利用RT-PCR鉴定SKOV3和3AO细胞株GADD45的表达。

  1.9 亲本细胞SKOV3和3AO诱导  在超净台内,用紫外线灯消毒,距离待测细胞20cm,垂直照射8min,5%CO2、37℃培养6~8h。RT-PCR测定其GADD45表达。

  1.10 转染细胞的诱导  用不同浓度的足叶己甙(VP16)诱导后,于5%CO2、37℃培养24h,测定细胞凋亡指标。

  1.11 细胞凋亡测定  ①碘化丙锭(PI)荧光染色流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡;②DNA“ladder”的测定:收集约5×106待检细胞,用细胞裂解液(1%NP40、20mmol EDTA pH8.0、50mmol Tris.Cl pH7.5)裂解,蛋白酶K消化,提取DNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V,2~3h)后观察结果。

  2 结果

  2.1 SKOV3和3AO细胞株,诱导后经RT-PCR鉴定缺乏GADD45基因的表达。

  2.2 Western Blot检测SKOV3和3AO细胞株野生型p53蛋白表达结果  SKOV3表达阳性;3AO为阴性,见照片1。

  2.3 重组质粒pcDNA-GADD45经Not-1和Kpn-1双酶切鉴定  在1.4kbp处可见一条带,重组成功,见照片2。

  2.4 RT-PCR检测转染GADD45基因的SKOV3和3AO细胞株经诱导后GADD45的表达,SKOV3-GADD45表达阳性;3AO-GADD45表达阴性,见照片3。

照片1 Western Blot测定SKOV3和3AO细胞株p35蛋白表达结果

  1:SKOV3细胞株蛋白 2:3AO细胞株蛋白

照片2 pCDNA-GADD45酶切鉴定结果

  1:pCDNA-GADD45经Kpn-Ⅰ和Not-Ⅰ双酶切产物可见在1.4kb处有一条带

  2:PBR322/BSTN-Ⅰ marker

  2.5 细胞凋亡测定  ①FCM分析结果:转染GADD45基因的细胞,经80μg/ml、160μg/ml的VP16诱导在培养24h后,SKOV3细胞株可出现G1期延长及细胞凋亡峰,3AO细胞株无明显的G1期延长及细胞凋亡峰出现。对照组和空白对照组均无G1期延长和细胞凋亡峰出现;②DNA“ladder”测定 转染GADD45基因的细胞经VP16 80μg/ml诱导,培养24h后,SKOV3细胞株可出现DNA“ladder”的表现,见照片4。3AO细胞株则无DNA“ladder”的表现。对照组和空白对照组均未出现DNA“ladder”的表现。

照片3 经UV诱导的SKOV3-GADD45,3AO-GADD45,RT-PCR鉴定结果

  1:3AO-GADD45 RT-PCR产物未见有条带

  2:SKOV3-GADD45 RT-PCR产物可见在1.4kbp处有一条带

  M:PBR322/BSTN-Ⅰ marker

照片4 VP16诱导SKOV3-GADD45细胞凋亡DNA“ladder” 1、2、3、4:不同浓度的VP16诱导培养24h 5、6:80μg/ml、160μg/ml的VP16培养24h

  3 讨论

  GADD基因组是在研究肿瘤发生、发展和转归过程中涌出的新发现,可在DNA损伤因素的作用下,发挥使细胞生长受抑和凋亡的作用[1]

  本实验结果表明,经RT-PCR鉴定无GADD45基因表达的OC细胞株SKOV3和3AO,和转入pcDNA-Ⅲ空质粒的SKOV3和3AO细胞株,经过VP16以及UV的诱导,均无G1期延长和细胞凋亡。而转入GADD45基因的SKOV3细胞株,诱导后G1期延长,并且进入细胞凋亡的状态。细胞凋亡与细胞增殖、分化一样,是一个级联式的基因表达结果。这一过程有许多癌基因和抑癌基因参与。GADD基因的表达可使细胞生长抑制在G1/G0期,或使肿瘤出现细胞凋亡[2]。在GADD基因表达缺失及在相关基因的作用下,细胞失控,使细胞增殖和抑制发生偏离,可能是组织发生肿瘤的原因之一。 Slichenmyer等[3]指出:GADD45是依赖于野生型p53作用的蛋白,它在肿瘤细胞凋亡中所起的级联桥梁作用是依赖p53途径实现的。在p53所致细胞凋亡和生长抑制的基因级联中,直接受p53调控,是连接p53和下一级细胞凋亡相关的重要中间环节,由此提示:p53的表达产物是GADD45的调节蛋白。

  本研究结果还表明,通过转染GADD45基因的SKOV3和3AO并筛选为阳性的细胞株,经FCM分析提示:SKOV3细胞株出现G1期延长和细胞凋亡状态;而3AO细胞株无G1期延长和凋亡。经过Western Blot鉴定;SKOV3细胞株有p53蛋白表达;3AO细胞株缺乏p53蛋白的表达。故本实验证实GADD45对肿瘤细胞的作用是依赖于正常p53的功能。在DNA损伤的应答中,损伤因子是通过一个转录后机制诱导野生型p53表达,阻断细胞周期,使损伤DNA得以修复[4]。这是因为p53蛋白产物可以延长细胞周期的进程,使细胞停滞于DNA复制启动之前,或复制之时。当肿瘤细胞转染GADD45基因,此基因的表达使DNA的损伤不可能恢复,而使细胞改道进入程序化死亡途径[5]

  参考文献

  1.Hollander MC,Alamc I,et al.Analysis of the mammalian GADD45 gene and its response to DNA damage J BiolChem 1993;15:268(32):2438

  2.Fornace A,Alamo I, et al.DNA damage inducible transcripts in mammalinan cell.Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:8800

  3.Slichenmyer WJ,Nelsos WJ,et al. Loss of a p53 associated Gl checkpoint does not decrease all survival following DNA damege.Cancer Res 1993;53:4164

  4.Miyashita T,Harigai M,et al.Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene.Cancer Res 1994;54;3131

  5.Fornace A,Alamo I,et al.DNA damage-inducible transcripts in mammalinan cells.Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:8800

(收稿日期 1998-06-20)


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