卵巢癌抗独特型疫苗(6B11mGM） 动物体内诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究
解剖学报 2000年第0期第31卷 论著
作者：崔恒 冯捷 昌晓红 叶雪 李艺 曹善津 付天云 姚煜 钱和年 刘蓓
单位：崔恒 冯捷 昌晓红 叶雪 李艺 曹善津 付天云 姚煜(北京大学人民医院妇科肿瘤中心，北京100044)；刘蓓(天津市中心妇产科医院实验室，天津300052）
关键词：卵巢癌；抗体；抗独特型；肿瘤疫苗；动物；实验
【摘要】目的 观察卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，mGM-CSF）的融合蛋白(6B11mGM）在小鼠体内诱导抗肿瘤免疫反应情况，探讨此种融合蛋白作为卵巢癌疫苗的可能性及适当的免疫方法。 方法 用融合蛋白6B11mGM免疫BA LB／c小鼠，制备抗血清。采用间接ELISA及免疫流式方法分析抗血清特征。 结果 经ELISA检测，融合蛋白6B11mGM免疫小鼠后，可诱导机体产 生AB3。同时可刺激小鼠脾脏淋巴细胞CD4＋细胞明显升高，CD8＋细胞略有升高。 结论 融合蛋白6B11mGM可诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫反应，为抗独特型卵巢癌疫苗用于临床奠定了基础。
【中图分类号】R737.31 【文献标识码】A 【文章编号 】0529-1357(2000）增-101
STUDY OF THE ANTITUMOR IMMUNE RESPONSES INDUCED in vi vo BY ANTI-IDIOTYPIC VACCINE OF OVARIAN CANCER(6B11mGM)
CUI Heng，FENG Jie，CHANG Xiao-hong，Y E Xue，LI Yi，CAO Shan-jin，FU Tian-yun，YAO Yu，QIAN He-nia n
(Gynecologic Oncology Center,Peking University People’Hospital,Beijing 10004 4， China;)
LIU Bei
(Laboratory of Central Obstetric and Gynecologic Hospital,Tianjin,300052,China )
【Abstrac】Objective To observe whether antitumor immune response c an be induced in BALB/c mice immunized with a fusion protein(6B11mGM) of anti-idiotypic single chain antibody (6B11scFv) and murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) instead of ovarian carcinoma antigen.Methods BALB/c mice were immuni zed repeatedly with 6B11mGM.Indirect ELISA test and immune flow cytometer were used for analyzing the characterization of anti-idiotypic ScFv(Ab3).Result s Ab3 could be detected in the sera of immunized mice with 6B11mGM by ELISA test .Moreover,it stimulated CD4+T cell from the spleen of BALB/c mice to proliferate and CD8+ T cell to proliferate slightly.Conclusion 6B11mGM probably induce b oth humoral and cellular immunity against ovarian carcinoma in vivo .It illus tra ted a strong basic for using fusion protein 6B11mGM as anti-idiotype vaccines a gainst ovarian carcinoma.
【Key words】Ovarian carcinoma;Antibody/anti-idioype;Tumor vaccine ;Animal;Laboratory 本中心采用杂交瘤技术制备出的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11，在动物实验已证明可代替卵巢癌相关抗原OC166-9，诱发特异性抗卵巢癌免疫反应［1］。但是鼠抗独特型抗体，作为疫苗反复应用于人体可诱导人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA）的产生。同时抗独特型抗体只模拟少数表位，免疫原性弱，应用时还需要佐剂。为了降低抗独特型抗体的鼠源性及提高其免疫原性，我们对本中心制备的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11进行系列改造，使之更适应临床应用。首先已成功构建了6B11单链抗体(6B11ScFv）［2］，随后又构建了6B11ScFv／人GM-CSF融合蛋白(6B11GM），通过融合蛋白形式，增强了抗独特型抗体的免疫原性，并且体外实验证明可引起以CD4＋为主的抗原特异性的T细胞增殖［3］，但由于缺乏合适的动物模型，而人GM-CSF和鼠GM-CSF尽管同源性很高［4］，结构相似，但它只能与各自相应的受体结合，没有交叉反应，具有绝对的种属特异性，即不能在鼠体内进行融合蛋白作为疫苗的效果和机制的体内实验，限制了进一步基础与临床研究。因此，构建与融合蛋白6B11GM特性相似，且能在动物体内进行实验的融合蛋白具有重要的意义。本中心采用基因工程和蛋白质工程技术，在6B11ScFv／hGM-CSF融合蛋白的基础上，构建了卵巢癌抗独特型单链抗体6B11与鼠GM-CSF(6B11ScFv／mGM-CSF）融合蛋白(6B11mGM）［5］。我们用融合蛋白6B11mGM免疫动物，观察其在动物体内诱导的特异性免疫应答情况，为融合蛋白6B11GM能早日用于临床卵巢癌主动免疫治疗奠定了基础。
材料和方法
1.主要材料与试剂
BALB／c小鼠：雌性，6～8周，购自北京大学医学部实验动物中心。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG，北京中山生物技术有限公司。异硫氰酸荧光素标记大鼠抗小鼠CD4、CD8：美国GIBCO公司。重组鼠GM-CSF纯品(美国R and D System）。福氏完全佐剂(CFA）和不完全佐剂(IFA）(美国Sigma公司）。
2．动物免疫计划
根据本中心以往免疫动物的经验，采用3次免疫方案，第1次为基础免疫，第2、3次为加强免疫。BALB／c小鼠共分8组，每组6～12只，分别以6B11ScFv、6B11ScFv+鼠GM-CSF、鼠GM-CSF、融合蛋白6B11mGM、6B11ScFV＋佐剂、6B11mGM佐剂＋佐剂，免疫动物。以OC166-9(Ag）免疫组为阳性对照，以注射等量PBS的正常鼠为阴性对照。
基础免疫：各组均采用100μg不同抗原，皮下3点注射(尾根皮下及双后趾底），其中，佐剂组加等量福氏完全佐剂(CFA）。于免疫后10、14d内眦取血，以间接法ELISA测血清中抗一抗独特型抗体(Ab3），计算3只小鼠的平均值。第1次加强免疫：将经基础免疫后的小鼠，于2周后进行第1次加强免疫，各组剂量为50μg，部位同基础免疫。其中佐剂组加等量福氏不完全佐剂(IFA），于该次免疫后10、14d，检测Ab3，方法同前。
第2次加强免疫：将经第1次加强免疫后的小鼠，于2周后进行第2次加强免疫，各组剂量为50μg，以水剂腹腔注射，分别于末次免疫后7、14、21、28d处死小鼠，取血、脾，以检测Ab3及小鼠脾细胞的T细胞表型变化。
3．标本制备方法
抗血清的制备：各次免疫间期，采用内眦取血，每次每组取血3只小鼠，分离血清；末次免疫后，每组每周处死3只小鼠取血，分离血清。各组免疫小鼠血清分别保存于－20℃，正常鼠为阴性对照，OC166-9(Ag）免疫组为阳性对照。
鼠脾淋巴细胞悬液的制备：处死小鼠后，立即取脾脏，置0.01mol／L pH7.4 PBS中，在平皿中研碎，以7号针头抽吸1次，再经过两次41-2针头，离心，弃掉上清，加3ml三蒸水，溶红细胞30s，立即加入1.8％NaCl，混匀。1200rpm，离心10min，弃掉上清0．01mol/L pH7.4 PBS洗1～2次。0.2％台盼蓝染色，活细胞计数法计数活细胞比例＞95％。用0.01mol／L pH7.4 PBS调整细胞数至所需浓度。
4．融合蛋白6B11mGM诱导特异性体液免疫反应-
Ab3抗血清特性鉴定
采用间接ELISA法检测：包被卵巢癌抗原OC166-9(2μg／ml），100μl／孔，4℃过夜，PBS-T洗3遍，加含1％BSA的PBS 100μl／孔，37℃温育1h，弃孔内液，PBS-T洗3遍后，加以1：20稀释的不同组免疫鼠抗血清及阴性(PBS）、阳性对照(COC166-9），100μl／孔，37℃温育1h，PBS-T洗3遍后，加1：1 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP）标记的羊抗鼠lgG，37℃温育1h，PBS-T洗3遍，每次5min，OPD显色，1mol/L H2SO4终止显色反应，测A490值。
5．T细胞表型(CD4、CD8）分析
采用流仪细胞仪(美国BD公司FACSTAR）作T细胞表型分析，标本制备如下：先在每管加入制备好的鼠脾细胞悬液50μl(1×106细胞），然后加入50μl，FITC标记的大鼠抗小鼠CD4和CD8，摇匀，4℃孵育45min；0．01mol／LpH7．4 PBS洗1～2次，1 500rpm，离心5min，弃上清；细胞沉淀用80％冷乙醇固定，4℃放置，检测前用PBS洗1次，加300μl PBS吹打悬浮后上机测定。结 果1．融合蛋白6B11mGM免疫BALB／c小鼠诱发的特异性体液免疫应答
Ab3特性鉴定：基础免疫后10d与第1次加强免疫后10d，各组鼠血清分别与卵巢癌初始抗原OC166-9结合活性进行比较。基础免疫后10d获得的各组鼠抗血清，用ELISA检测证明除阳性对照外，各组与卵巢癌初始抗原OC166-9均无明显结合。第1次加强免疫后10d获得的抗血清，用ELISA检测证明，融合蛋白6B11mGM免疫组Ab3水平明显高于除阳性对照组以外的其他对照组Ab3水平(表1，图1）。
表1 不同免疫原免疫BALB/c鼠诱导产生Ab3水平
Table 1 The levels of Ab3 induced by different immunogens in BALB/c mice
| 第1次加强免疫后10d
10 days after first boosting |
基础免疫后10d
10 days after immunization |
| 免疫组别
groups |
血清稀释度
dilution |
剂量(μg)
dose(μg) |
Ab3(A490)
Ab3(A490) |
剂量(μg)
dose(μg) |
Ab3(A490)
Ab3(A490) |
| 正常对照
controls |
1∶20 |
- |
0.236 |
- |
0.157 |
| OC166-9 |
1∶20 |
100 |
0.947 |
50 |
1.300 |
| 6B11ScFv |
1∶20 |
100 |
0.263 |
50 |
0.418 |
| 6B11ScFv+
mGM-CSF |
1∶20 |
100+0.8 |
0.173 |
50+0.5 |
0.328 |
| mGM-CSF |
1∶20 |
0.8 |
0.213 |
0.5 |
0.538 |
| 6B11mGM |
1∶20 |
100 |
0.242 |
50 |
0.853 |
图1 间接法ELISA检测鼠血清Ab3
Fig.1 Indirect ELISA analysis of Ab3
第1次加强免疫后14d，6B11ScFv及6B11mGM加佐剂与不加佐剂所诱导的Ab3水平比较：单纯用6B11ScFv与6B11ScFv加佐剂免疫小鼠所诱导的Ab3水平无明显变化；单纯用6B11mGM和6B11mGM加佐剂免疫所诱导的Ab3水平亦无明显变化，但两者诱导的Ab3水平均明显高于用6B11ScFv免疫组(图2）。
图2 间接ELISA检测鼠血清Ab3
Fig.2 Indirect ELISA analysis of Ab3
2．融合蛋白6B11mGM末次免疫后Ab3水平及持续时间
经100μg 6B11mGM皮下注射基础免疫后，间隔2周给予50μg 6B11mGM皮下接种，再2周后以50μg 6B11mGM水剂腹腔注射，于末次免疫后7、14、21、28d分别处死小鼠3只，用间接ELISA检测血清Ab3。血清稀释度均为1：20。结果显示，6B11mGM末次免疫后，BALB／c小鼠血清Ab3水平很快升高；免疫后7d，Ab3A490为1.188，14d为1.004，21d为0.906，28d为0.710，以末次免疫后7d Ab3水平最高，28d后仍高于阴性对照2倍以上(图3）。
图3 Ab3水平与免疫后持续时间
Fig.3 Ab3 level versus duration after immunization
3．融合蛋白6B11mGM对T细胞表型的影响
于末次免疫后7、14、21、28d分别处死小鼠，取脾，用流式细胞仪检测小鼠脾脏淋巴细胞表型(表2），结果可见，末次免疫后CD4＋细胞比率增加，CD8＋细胞比率略有上升，并维持在一定水平，由于CD4＋细胞和CD8＋细胞比率均有增加，因此CD4＋／CD8＋比值无明显变化。
表2 6B11mGM 3次免疫BALB/c鼠后T细胞表型变化
Table 2 The change of T lymphocyte phenotype by 6B11mGM after secondary boosting
| |
正常鼠
normal mouse |
6B11mGM末次免疫后时间(天)
days after last immtunity with 6B11mGM |
| |
|
7 |
14 |
21 |
28 |
| CD4+(%) |
25.85 |
37.40* |
40.60* |
35.55* |
33.65* |
| CD8+(%) |
10.10 |
15.20* |
14.87* |
13.83* |
14.90* |
| CD4+/CD8+ |
2.56 |
2.46 |
2.73 |
2.57 |
2.26 |
*与正常鼠相比P＜0.01 (Compared with normal mice P＜0.01)
讨 论
基于免疫网络学说，抗原内影像型抗独特型抗体既能模拟肿瘤抗原又能表达不同于肿瘤抗原的“分子环境”，它通过刺激“静止克隆”和活化Th细胞，增强免疫反应，克服免疫耐受，因此在肿瘤主动免疫治疗中具有广阔的应用前景。本中心在过去的实验中以完整的卵巢癌内影像型抗独特型抗体6B11(Ab2β）免疫肾包膜下移植瘤杂交小鼠动物实验中表明，能够激机体产生抗肿瘤体液和细胞免疫应答［1］。为了降低6B11的鼠源性，本中心利用基因工程技术成功制备了6B11抗独特型单链抗体6B11ScFv［2］。由于去除了Fc段，6B11ScFv分子量减小，免疫原性随之减弱，单独用6B11ScFv诱导的免疫反应可能较弱，为此，我们制备了6B11ScFv和人GM-CSF的融合蛋白(6B11GM），以增加6B11ScFv的免疫原性，但这种新的蛋白能否模拟卵巢癌初始抗原诱导动物体内产生肿瘤免疫反应，有必要进行探讨，以便为融合蛋白6B11GM作为独特型疫苗尽早应用于临床提供依据。
1．融合蛋白6B11mGM可诱导特异性液体免疫反应
许多研究表明，抗独特型抗体(Ab2β）诱导产生的特异性体液免疫在抗肿瘤免疫中起重要作用。Wagner等用模拟相关抗原CA125的抗独特型抗体ACA125作为疫苗治疗了16例晚期卵巢癌或复发的上皮性卵巢癌患者，其中9例患者诱导产生了Ab3，且平均无进展生存期为11个月，而Ab3阴性组为8个月［6］，另外一些研究也证实，Ab2β可诱导机体产生Ab3，延长患者的生存期，并能介导CDC和ADCC。本研究分别用卵巢癌抗独特型单链抗体(6B11ScFv）、6B11ScFv与鼠GM-CSF(mGM-CSF）混合蛋白、mGM-CSF及融合蛋白6B11mGM作为抗原免疫BALB／c鼠。结果显示，6B11mGM诱导体内产生的抗-抗独特型抗体(Ab3）水平明显高于单独用6B11ScFv、6B11ScFv与mGM-CSF混合蛋白及mGM-CSF免疫组。另外，单独用6B11mGM与6B11mGM辅以佐剂免疫小鼠，所产生的Ab3水平无明显变化，提示融合蛋白6B11mGM作为疫苗，在不用任何载体蛋白及佐剂情况下，就可诱导机体产生特异性体液免疫反应。采用间接ELISA法检测3次免疫后不同时间(天数）Ab3的水平及持续时间发现，在末次免疫后7d，Ab3水平最高，持续至末次免疫后28d Ab3仍维持在较高水平。融合蛋白6B11mGM能否诱导出更高水平的Ab3以延长Ab3的持续时间与免疫剂量、重复免疫间隔时间及免疫途径等均有关，还需要进一步摸索。
2．融合蛋白6B11mGM可引起CD4＋为主的抗原特异性T细胞增殖
本研究用6B11mGM在不使用任何载体蛋白及佐剂情况下，3次免疫BALB／c鼠后，可引起小鼠脾脏淋巴细胞CD4＋细胞升高，CD8＋细胞略有升高并维持在一定水平，说明融合蛋白6B11mGM有可能激活CD4＋T细胞，调动机体的细胞免疫功能。一些研究表明抗独特型抗体可以通过MHCⅡ限制的途径激活CD4＋细胞。对Buckley等［7］用Ab2治疗术前结肠癌患者，术后肿瘤组织免疫组织化学检测到有CD4＋细胞和NK细胞聚集，自身肿瘤细胞杀伤活性增加。我们以前的研究也表明，完整的卵巢癌抗独特型抗体6B11在杂交小鼠肾包膜下移植瘤动物实验中，诱导出了以CD4＋细胞为主的特异性细胞免疫反应。另外，卵巢癌抗独特型单链抗体与人GM-CSF融合蛋白6B11GM在体外实验中表明，在APC和DC存在情况下，可诱导CD4＋T细胞的增殖。APC表达MHCⅠ类分子增加，而不加APC时，T细胞无明显增殖。APC对6B11GM的摄取明显高于单用6B11时［3］。因此推测，本研究所采用的6B11mGM融合蛋白在抗肿瘤免疫中可能是以CD4＋T细胞为主要效应细胞。CD4＋T细胞可产生淋巴因子，加强CTL的功能并可激活巨噬细胞或其他APC，从而参与抗瘤作用。
3．融合蛋白6B11mGM增强免疫反应的可能机制
本研究结果显示，融合蛋白6B11mGM比单纯用6B11ScFv免疫小鼠，能引起更强的免疫反应：同时6B11mGM比6B11ScFv加上mGM-CSF混合蛋白及6B11ScFv加佐剂免疫动物能诱导产生更高水平的体液免疫：而单纯用6B11mGM 与6B11mGM加佐剂所诱导的免疫反应无明显差别，提示采用融合蛋白的形式，可在无任何载体蛋白及佐剂情况下，就可诱导产生较高水平的特异性免疫反应。融合蛋白6B11mGM有可能通过以下机制来增强免疫反应。
特异性免疫反应：包括体液免疫和细胞免疫。融合蛋白6B11mGM中的卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv可模拟卵巢癌初始抗原OC166-9，刺激机体产生特异性免疫反应。结果显示6B11mGM可诱导产生高水平的Ab3，同时又可刺激鼠脾脏淋巴细胞CD4＋细胞明显升高，CD8＋细胞也略有升高，并维持在一定水平。根据细胞免疫理论推测，其中CD4＋辅助性T细胞(Th）可以通过产生淋巴因子增强CTL的功能。CD8＋细胞主要通过其抗原受体识别肿瘤细胞上的特异性抗原，并在Th辅助下活化后直接杀伤肿瘤细胞。因此，融合蛋白6B11mGM有可能通过CD4＋和CD8＋T细胞相互协同来杀伤肿瘤细胞。
免疫调节机制：免疫网络学说认为，抗独特型抗体(Ab2）的V区一方面与Ab1V区特异性结合，起调节Ab1的作用；另一方面活化其他Id＋B淋巴克隆，产生Ab3……，起到了免疫调节的作用［8］。融合蛋白6B11mGM有可能起到抗独特型抗体模拟抗原及免疫调节双重作用。这也正是抗独特型疫苗与其他肿瘤疫苗的主要不同之处。提示当抗独特型疫苗进入体内后，有可能以很小的剂量就可引起放大式免疫反应，从而在较安全的情况下，起到打破晚期肿瘤患者免疫耐受或免疫抑制状态，使病人得以长期带瘤存活，并在一定程度上提高患者的生活质量。
非特异性免疫反应：融合蛋白6B11mGM中的、GM-CSF有可能通过非特异性免疫方式在增加机体免疫反应中起到了重要作用。许多研究表明GM-CSF可促进DC的发育成熟、促进APC表达MHCⅡ类分子和共刺激分子，增加抗原提高能力［9］。另外，GM-CSF还可通过局部炎症反应来增加免疫反应［10］。Liehl等［11］将BSA作为抗原与GM-CSF同时局部注射，可引起高滴度的抗体产生，而单独注射BSA则未能检测到抗体，表明GM-CSF有促进免疫反应的作用，且必须与抗原在同一部位注射。提示GM-CSF需要在抗原局部形成长期有效的浓度，才能起到增强免疫反应的作用。Tao等［12］报道，在动物实验中，恶性B细胞淋巴瘤中表达的免疫球蛋白分子的可变区(独特型，idiotype，Id）必须和GM-CSF构成融合蛋白，才能诱导抗肿瘤免疫反应。本研究构建的融合蛋白6B11mGM既可起到抗原作用，又可在抗原局部产生有效浓度的GM-CSF。近年来的研究表明，GM-CSF在激活T细胞中与ⅠL-2起协同作用［13］。能增加LAK细胞，NK细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。更重要的是，6B11mGM中的鼠GM-CSF与APC上的GM-CSF受体结合，即GM-CSF在能模拟卵巢癌抗原的6BIIScFv 与APC之间起到“分子桥”样作用，从而促进了APC对抗原的摄取。因此，采用融合蛋白的形式更有利于抗独特型抗体与细胞因子发挥协同作用。其更加确切的作用机制，仍有待于进一步作更加细致的工作。
【基金项目】教育部优秀年轻教师基金资助项目
【作者简介】崔恒 (1956—），男(汉族）辽宁盖县人，博士，副主任医师
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【收稿日期】2000-06-23 【修回日期】2000-07-21
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