急性早幼粒细胞白血病对全反式维甲酸耐药的机制及其逆转

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：姜国胜　唐天华　毕可红　张玉昆　董强　李岩　任海泉　姜枫勤　任青华　赵良玉

单位：姜国胜（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)；唐天华（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)；毕可红（山东省千佛山医院)；张玉昆（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)；董强（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)；李岩（山东省千佛山医院)；任海泉（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)；姜枫勤（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)

　　关键词： 白血病，急性早幼粒/药物疗法；维甲酸/治疗应用；药物耐受性

　　【摘要】　目的　揭示急性早幼粒细胞白血病(APL)产生维甲酸耐药的机制，探讨耐药性逆转的方法。方法　MTT法测定细胞增殖，极限稀释法诱导APL细胞耐药性。RT-PCR及流式细胞仪测定MDR1、消炎痛及PGE₁增殖影响实验分别间接测定GST酶活性或cAMP作用。干扰素、高三尖杉酯碱(HHT)及三氧化二砷(As₂O₃)进行体外耐药细胞逆转实验。结果　对全反式维甲酸(ATRA)耐药的HL60细胞MDR1阴性，初发时MDR1为阴性的APL患者复发后仍为阴性。消炎痛对耐药的HL60增殖分化无影响，前列腺素E(PGE)可部分恢复ATRA对耐药HL60的作用。干扰素可明显逆转HL60的耐药性。As₂O₃与HHT对ATRA耐药的HL60细胞有明显作用。结论　APL细胞耐药并非多药耐药，消炎痛或干扰素明显逆转其耐药性，ATRA与As₂O₃化疗药无交叉耐药性。

Drug resistance of acute promyelocytic leukemia (APL) to all-trans retinoic acid (ATRA) and its reversion

JIANG Guosheng, TANG Tianhua, BI kehong, et al.

　　（Department of Hematology and Oncology, Institute of Basic Medicine, Shandong academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the mechanism of drug resistance of APL to ATRA and the methods of reversion.Methods　ATRA-resistant HL60 cell line and bone marrow (BM) leukemia cells from recurrent APL patients who did not respond to aTRA treatment were used in this study. Multiple drug resistance gene (mdr1) expression was determined by RT-PCR and flow cytometry. Cell proliferation and differentiation were assessed by MTT uptake and NBT reduction respectively.Results　The response of ATRA-resistant HL60 and APL cells from recurrent patients to the differentiation inducing activity of ATRA was significantly reduced, and ATRA had little effect on cell proliferation. Expression of mdr-1 was nagative in aTRA-resistant HL60 cells. It was negative in resistant APL cells even after aTRA treatment. Arsenic trioxide and homoharringtonine (HHT) could inhibit proliferation of HL60 and ATRA-resistant HL60 cells, indicating no cross-resistance with ATRA. Interferon alpha (IFN-α) and PGE₁ could significantly inhibit proliferation of ATRA-resistant HL60 cells and restore cell differentiation induced by ATRA.Conclusion　Drug resistance of APL to ATRA is not related to mdr-1. It can be reversed by IFN-α. there is no cross-resistance between HHT or arsenic trioxide and ATRA.

　　【Subject words】　Leukemia, acute promyelocytic/drug therapy;　Retinoic acid/therapeutic use;　Drug resistance

　　急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)约占同期白血病的3.3%～17.4%左右^［1］。尽管1986年国内首创的全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)诱导分化疗法可使其完全缓解(CR)率达85%以上^［2］，但快速发展的耐药与高复发率仍是影响长期疗效的两大障碍。为此，我们对APL患者的ATRA耐药机制及逆转耐药的方法进行了初步研究。

　　材料与方法

　　一、HL60或原代APL细胞ATRA耐药性诱导及生长曲线测定

　　以0.1 ml HL60细胞(含2×10⁵个细胞)加入96孔板中，按浓度倍增法诱导ATRA(上海第六制药厂)耐药，于10^-6 mol/L ATRA浓度生长良好时为止。再将此耐药HL60细胞(2×10⁵/ml)加于不同浓度的ATRA(10^-9～10^-5 mol/L)条件下体外培养72 h，本室常规以MTT法检测细胞增殖曲线。以APL患者复发后ATRA治疗无效的骨髓细胞为原代APL细胞，测定其生长曲线。

　　二、ATRA耐药HL60细胞对ATRA诱导作用的改变

　　将HL60细胞、耐ATRA HL60或原代APL细胞均按5×10⁵/ml培养于常规浓度ATRA(10^-7～10^-5 mol/L)中，按文献［3］方法测定第7天的硝基蓝四氮唑(NBT)阳性细胞百分率。

　　三、ATRA耐药HL60或原代APL细胞MDR1基因测定

　　ATRA耐药前后的HL60细胞或原代APL细胞(来源于8例APL患者，年龄37.6±16.8岁，初治与8个月～2.2年复发时的骨髓细胞)按文献［4］方法或流式细胞仪两种方法测定MDR1基因。

　　四、ATRA耐药HL60细胞的逆转研究

　　1.交叉耐药性检测：0.1 ml三氧化二砷(As₂O₃)(10^-9～10^-4 mol/L，Sigma公司)或高三尖杉酯碱(HHT，10^-9～10^-4μg/ml，中国医学科学院实验药厂)加入盛有0.1 ml(10⁶/ml)耐药HL60细胞的96孔板中，37℃，5% cO₂，饱和湿度培养96 h，MTT法测定增殖性，以细胞比活率表示：

　　2.干扰素α(IFNd)的耐药逆转性实验：0.1 ml耐药HL60(10⁶/ml)与0.1 ml不同浓度的IFNα 2A(沈阳三生制药厂)加入96孔板中，37℃，5%CO₂条件下培养96 h后，弃上清，加10^-6 mol/L ATRA 0.2 ml/孔，培养96 h后，按MTT法测细胞增殖性，NBT法测定其分化性。

　　3.消炎痛与PGE对ATRA耐药HL60细胞增殖的影响：

　　消炎痛(潍坊医药集团)以生理盐水稀释成5 μg/ml，并以0.1 ml加入含有10⁶耐药HL60细胞的96孔板中，常规培养96 h后，加入ATRA(10^-10～10^-5 mol/L) 0.1 ml，继续培养72 h，MTT法测定细胞增殖性改变。同法测定PGE(10μg/2 ml，北京泰德制药厂生产)，终浓度为0.1 μg/孔的作用。

　　结果

　　一、ATRA耐药HL60或原代APL细胞生长曲线

　　HL60细胞在10^-10～10^-5 mol/L 6个浓度ATRA时，A₅₇₀-A₆₃₀差值分别是0.41±0.08，0.38±0.07，0.285±0.05，0.22±0.04，0.18±0.03，0.138±0.04；原代耐药APL细胞在10^-10～10^-5mol/L6个浓度ATRA时，A₅₇₀-A₆₃₀差值分别为0.41±0.06，0.49±0.07，0.51±0.08，0.48±0.04，0.515±0.08，0.50±0.06；耐药HL60细胞相应A₅₇₀-A₆₃₀差值分别为0.35±0.07，0.327±0.05，0.355±0.043，0.349±0.06，0.39±0.03，0.40±0.04。结果显示，不同浓度ATRA体外对HL60有明显抑制增殖作用，而对耐药HL60或原代APL细胞无明显抑制作用(P＞0.05)。

　　二、ATRA耐药HL60细胞及原代APL细胞分化性变化

　　于10^-7，10^-6，10^-5 3个ATRA浓度下，对照HL60细胞NBT阳性率分别为(57.2±13.8)%，(78.2±14.1)%和(81.5±9.3)%；耐药HL60细胞分别为(9.9±4.35)%，(16.5±5.7)%和(20.9±6.2)%；耐药原代APL细胞为(5.5±2.3)%，(11.22±4.6)%和(15.4±5.9)%。经统计分析，ATRA耐药HL60或原代APL细胞对ATRA的诱导分化反应性明显降低(P＜0.05)，形成耐药。

　　三、ATRA耐药HL60或原代APL细胞MDR-1检测结果

　　耐药HL60细胞经RT-PCR测定，MDR1为阴性。而8例APL患者初发时有2例原代细胞MDR1阳性，6例MDR1阴性；复发后，MDR1基因测定结果未发生变化。说明ATRA耐药并非MDR1介导，流式细胞仪测定亦为同样结果。

　　四、有关化合物对ATRA耐药HL60细胞增殖和诱导分化的影响

　　1.As₂O₃或HHT对ATRA耐药HL60细胞的作用：由图1可见，HHT或As₂O₃对正常HL60或对ATRA耐药的HL60细胞有明显增殖抑制作用，且各浓度对两种细胞的抑制程度差异无显著性(P＞0.05)。

图1　As₂O₃与HTT对耐药HL60细胞增殖的影响

　　2.IFNα 2A对ATRA耐药HL60细胞增殖与分化的影响：

　　(1)IFNα 2A对ATRA耐药HL60细胞增殖的影响：ATRA耐药HL60细胞与500 u/ml、1 000 U/ml和2 000 U/ml 3个浓度IFNα 2A，10^-6 mol/L ATRA作用96 h，对应A₅₇₀-A₆₃₀差值分别为0.203±0.042、0.145±0.038和0.116±0.056；而RPMI1640+ATRA耐药HL60细胞对照的A₅₇₀-A₆₃₀差值为0.261±0.047。后者明显高于上述各A值(P＜0.05)。说明该实验浓度IFNα2A可恢复ATRA对其耐药HL60细胞的抑制作用。

　　(2)IFNα对ATRA耐药HL60细胞分化作用的影响：ATRA耐药HL60细胞在10^-6 mol/L ATRA浓度下，细胞NBT阳性率较低，而不同浓度的IFNα处理的ATRA耐药HL60细胞在10^-6 mol/L ATRA浓度下，NBT阳性细胞百分率升高。250，500，1 000，2 000 u倍数稀释IFNα 2A，对应的NBT阳性率分别为(14.9±4.6)%、(17.6±5.2)%、(21.5±6.3)%和(26.9±7.8)%，均高于RPMI1640处理的ATRA耐药HL60对照组(4.4±2.3)%，表明IFNα 2A可恢复ATRA诱导分化作用。

　　3.PGE₁或消炎痛对ATRA耐药HL60细胞增殖的影响：正常10⁶/孔HL60细胞，A₅₇₀-A₆₃₀差值为0.44±0.057(3例)，10⁶/孔耐药HL60细胞在5×10^-6 mol/L ATRA作用下，A₅₇₀-A₆₃₀ 差值为0.43±0.064(3例)，两者A值差异无显著性(P＞0.05)。经PGE₁或消炎痛予处理后，10⁶/孔耐药HL60细胞，在5×10^-6 mol/L ATRA浓度下，A₅₇₀-A₆₃₀差值为0.271±0.058和0.413±0.061(3例)，PGE₁组A值明显低于耐药HL60组(P＜0.01)。说明PGE可部分恢复ATRA对耐药HL60细胞增殖的抑制作用。

　　讨论

　　APL患者经ATRA诱导治疗后，85%以上患者获得缓解^［2］，由此成为肿瘤诱导分化疗法的最成功模式。然而，随着临床进一步应用，发现其可形成耐药性并使复发患者难以再次获得缓解。为此，国内外学者进行了多方探讨，现已证实，长期口服ATRA后，即使增加剂量，其血浆浓度仍不能明显升高^［4］，提示ATRA药代学的改变与耐药形成有关。但是复发APL原代细胞在体外对ATRA的不敏感性及对ATRA耐药细胞株的诱导成功^［5］，均提示在药代动力学以外，仍然存在其他更为复杂的细胞内部机制。部分学者初步证明，细胞色素P450酶及GSH/GST系统发挥一定作用^［6］，或者与细胞内CRABP(细胞维甲酸结合蛋白)增高有关^［7］，但尚无令人信服的结论。

　　传统化疗药物一般诱导MDR1基因介导的多药耐药，而ATRA耐药与MDR1的关系少见报道。本研究结果表明，对ATRA耐药的HL60细胞或耐药原代APL细胞的MDR1均为阴性，初步排除了MDR1介导的多药耐药机制。多药耐药形成的另一机制与GSH/GST系统有关，而ATRA诱导耐药HL60细胞经GST抑制剂消炎痛处理后，并不能明显恢复其对ATRA作用的敏感性；间接提示GSH/GST并非ATRA耐药的主要机制。

　　国外学者发现，在辅酶A的参与下，ATRA可对HL60细胞的cAMP依赖蛋白激活酶亚单位起酰化作用(维甲酸化)，从而促进HL60细胞分化^［8］。本研究结果亦证实，cAMP提高剂PGE₁可部分恢复耐药HL60细胞的敏感性，说明此结果与国外报道一致。体外实验中，ATRA耐药HL60细胞对As₂O₃或化疗药HHT均具较高的敏感性，表现为明显增殖抑制性，说明ATRA或As₂O₃与ATRA之间无明显交叉耐药。提示临床上ATRA耐药后，仍可用As₂O₃或化疗药治疗。

　　据文献报道，干扰素对化疗药物(如烷化剂)具有明显的逆转耐药作用^［9］，ATRA与干扰素联合治疗APL也有防止耐药形成的作用^［10］。本研究结果表明，干扰素的确能恢复耐药HL60细胞体外对ATRA的反应性，具体表现在分化与增殖两方面敏感性的恢复，故其具有很好的临床应用潜力。

　　基金项目：山东省科委项目(951228104)

　　作者单位：任青华（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)

　　赵良玉（山东省医学科学院基础医学研究所血液肿瘤研究室，济南，250062)

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收稿日期：1999-04-09