白血病细胞核基质蛋白的初步研究

中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 基础研究

作者：李娟　任显辉　黄兆伟　金月英　王子慧　邱殷庆

单位：510080 广州，中山医科大学第一附属医院血液内科(李娟)；香港沙田香港中文大学医学院解剖系(任显辉、黄兆伟、王子慧、邱殷庆)；北京医科大学细胞学系(金月英)

　　关键词： 白血病；核基质蛋白

　　 　　【摘要】　目的　比较白血病细胞与正常骨髓细胞核基质成分的差异。方法　用高盐法抽取细胞核基质蛋白,SDS-PAGE和Western Blotting分析和观察了急性粒细胞性白血病和慢性粒细胞白血病慢性期、急粒变期及化疗前后白血病细胞核基质蛋白的改变。结果　慢性粒细胞白血病慢性期、急粒变期及急性粒细胞白血病细胞核基质与正常者有明显差异，主要改变是白血病细胞分别在某些区带出现新的核基质蛋白或核基质蛋白含量的增加，慢性粒细胞白血病急性变后与慢性期相比也在某些区带出现新的核基质蛋白或核基质蛋白含量的增加。化疗前后白血病细胞核基质蛋白成分的比较，表现为化疗后核基质蛋白明显减少。结论　白血病细胞与正常骨髓细胞相比，核基质蛋白有明显的差异，核基质蛋白成分的改变可能与白血病的发生、发展以及慢性粒细胞白血病的急性变有关，核基质是某些抗癌药物的作用位点。

　　 Study on nuclear matrix protein in leukemia cells　　Li Juan, Ren xianhui, Huang Zhaowei, et al. The First Affiliated Hospital, Sun Yetsen University of Medical Sciences ,Guangzhou 510080

　　【Abstract】　Objective　To compare the composition of nuclear matrix proteins(NMP) between leukemia cells and normal bone marrow cells. Methods　NMP was isolated by high-salt extration and identified by sDS-PAGE and western blotting. Results Increase in NMP was demonstrated in acute and chronic myelogenous leukemic cells as well as in the blast phase of chronic leukemia. On sDS-PAGE, NMPs with molecular weight different from what were seen in normal bone marrow cells were present in both acute and chronic myelogenous leukemias. Conclusion Marked changes of NMP, not only in contents but also in compositions, exist in leukemic cells compared with normal bone marrow cells. NMP may serve as a target of chemotherapeutic drugs against leukemia.

　　【Subject words】　Leukemia　　Nuclear matrix proteins

　　 　　 白血病是危害人类的恶性血液病，其病因及发病机理尚未完全明确。核基质是细胞核内一种动态非染色质结构，它不仅是维持细胞核形态的支架，而且在DNA复制染色体功能构建、基因表达等方面起着主要的作用。目前的研究发现，恶性肿瘤细胞核基质成分与正常细胞相比有明显的差异^［1］。我们对几种类型的白血病细胞和一种白血病细胞系的核基质进行了初步研究，并对慢性粒细胞白血病的转化及慢性粒细胞白血病急性变联合化疗前后的核基质的变化进行了追踪观察。

材料与方法

　　1.标本来源：白血病的诊断和分类按国际FAB分类法，病例1为慢性粒细胞白血病慢性期至急粒变期，病例2和病例3为慢性粒细胞白血病急粒变期，病例4为急性粒细胞白血病。于病例1的慢性期、急粒变期，病例2和病例3两患者化疗前及化疗停止后第7～8天，病例4化疗前分别取外周血20 ml，用Ficoll液分离出单个核细胞，PBS洗3次。正常对照：1例取自异体骨髓移植供体的骨髓细胞，1例取自肋骨骨髓细胞，分离方法同前。

　　2.细胞培养：慢性粒细胞白血病红白血病变细胞系(K562)培养于含10％FBS的RPMI1640中。

　　3.核基质蛋白的提取及SDS-PAGE电泳：参照Fey等^［2］的方法提取核基质蛋白。细胞骨架（CSK）缓冲液（100 mmol/L sucrose,0.5％ tritonx-100）15分钟4℃，离心后沉淀置于含有100 μg/ml DNaseⅠ和RNaseA的消化液中，室温下作用20分钟，加入终浓度为0.25 mol/L的冷硫酸铵，离心，沉淀溶于disassembly缓冲液（8 mol/L Urea,20 mmol/L Mes pH6.6， 1 mmol/L EGTA,1 mmol/L PMSF,0.1 mmol/L MgCl₂，1％2-ME）中，于4℃ 1∶1 000体积的透析液（0.15 mol/L KCl,25 mmol/L imidazole,pH 7.1, 5 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L DTT,0.125 mmol/L EGTA,0.2 mmol/L PMSF）中透析16小时，超速离心，上清液用2.5倍的纯酒精使核基质蛋白沉淀，每个样品用10μg进行SDS-PAGE电泳，银染。

　　4.Western blotting:病例2行化疗前后的细胞核基质蛋白经12％SDS-PAGE电泳后，电转移至NC膜上，用鼠抗扑拓异构酶Ⅱ作Ⅰ抗体（Sigma），驴抗鼠作Ⅱ抗体（Sigma），ECL荧光显色

结果

　　1.正常骨髓细胞与慢性粒细胞白血病慢性期、急粒变期和急性粒细胞白血病核基质蛋白的比较：从SDS-PAGE电泳结果来看（附图），急性粒细胞白血病细胞与正常细胞相比，核基质蛋白成分增加，在分子量20 000～50 000和97 400～200 000处出现多个正常相应细胞所没有的蛋白带；慢性粒细胞白血病慢性期与正常细胞相比，在分子量为25 000及94 700～200 000处出现多个新蛋白带，而在分子量为40 000，45 000区带蛋白量增多；两例慢性粒细胞性白血病急粒变期化疗前与正常骨髓细胞相比，病例2在分子量为30 000～50 000,80 000处、病例3在30 000～40 000及97 400～20 000处出现与正常细胞相比所没有的蛋白。

　　K：K562；AC：病例1患者慢性期；AB：病例1急粒变期；N1：正常骨髓细胞；N2：正常骨髓细胞；Bb：病例2患者化疗前；Ba：病例2患者化疗后；Cb：病例3患者化疗前；Ca：病例3患者化疗后；M1：急性粒细胞性白血病；M：标准分子量

附图　SDS-PAGE电泳结果

　　2.病例1在慢性粒细胞性白血病慢性期、急粒变期细胞核基质蛋白成分的比较：从SDS-PAGE电泳图上可以看出，病例1在慢性期、急粒变期细胞核基质蛋白成分相似，但急粒变后核基质蛋白成分增加或某些区带蛋白量增加，如在分子量为44 000，50 000，58 000，90 000处出现新的蛋白带，分子量为20 000处蛋白量增多。

　　3.K562与病例2，3患者化疗前后核基质蛋白的区别：分子量在45 000～200 000处相似，在21 500～45 000之处有较大的区别，主要是病例2，3患者出现多个不同的蛋白带或在这个范围内某些区带蛋白量增多。

　　4.病例2,3患者化疗前后细胞核基质蛋白的变化：病例2化疗后在分子量为30 000～40 000，50 000～60 000及200 000处蛋白消失，在35 000～65 000处蛋白量减弱;病例3化疗后在分子量为35 000～45 000处蛋白带消失，在20 000～35 000及66 000～200 000处蛋白量减弱。Western blotting结果显示，化疗前病例2核基质蛋白成分中，扑拓异构酶Ⅱ强阳性，化疗后病例2扑拓异构酶Ⅱ消失。

讨论

　　核基质的结构和功能很复杂，核基质蛋白成分不仅有组织特异性，而且与细胞类型有关^［3］，肿瘤细胞与正常相应细胞的核基质蛋白成分有明显的区别^［1］。本研究中，急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病细胞与正常相应骨髓细胞的核基质蛋白成分有明显的区别，主要表现为白血病细胞在某些区带出现新的蛋白或蛋白含量增加。例如：急性粒细胞白血病患者在分子量为20 000～25 000、30 000～50 000及97 400～200 000处出现10多种新的蛋白质；慢性粒细胞白血病在慢性期的白血病细胞与正常相应骨髓细胞的核基质蛋白成分有区别，而发生急粒变后，这种改变更显著；在慢性粒细胞白血病慢性期仅见分子量在25 000和97 400处出现两种新的蛋白，在40 000,45 000处蛋白量增多，急粒变后这种新的蛋白出现增多。病例2在分子量为30 000～45 000，80 000处和病例3在25 000～40 000及97 400～200 000处均出现7种以上新的核基质蛋白成分，这种现象可能与白血病的发生、发展密切相关，进一步研究这些新的核基质蛋白的功能，将有助于揭示白血病的发病机理。

　　慢性粒细胞白血病急粒变是在慢性粒细胞白血病慢性期基础上细胞由中、晚幼粒细胞阶段向原始粒细胞阶段的转变过程，发生急粒变后细胞的分化程度更差，恶性程度更高，其核基质蛋白成分也发生明显改变。本组病例1发生急粒变后核基质成分较其慢性期有较多的核基质蛋白成分出现，在分子量为45 000～60 000,90 000有新的核基质成分出现，200 000处蛋白量增多。慢性粒细胞白血病急粒变后新的核基质蛋白成分出现与慢性粒细胞白血病转变有关，但这些新的核基质蛋白成分在慢性粒细胞白血病转变中的作用及机制尚需进一步探讨。

　　K562与病例2，3患者都是慢性粒细胞白血病急粒变，但由于细胞转化的方向不同，它们的核基质蛋白之间也有区别，K562是慢性粒细胞白血病向红白血病变，病例2，3患者是慢性粒细胞白血病向急性粒细胞白血病转变，由于转变后细胞成分有区别，它们的核基质蛋白成分也有不同的改变。

　　近年的研究结果表明^［4］，核基质是许多化疗药物的作用位点。本研究中病例2，3患者经HAE方案化疗，化疗后第7～10天是大部分化疗药物作用的高峰，因此，在药物作用最高峰的时期取出其白血病细胞与化疗前核基质蛋白成分进行比较意义更大。HAE方案中，HAT有使真核细胞多核糖体解聚的作用，释放新生肽链，从而抑制蛋白质的合成；Ara-C对肿瘤细胞的作用是先经脱氧胞苷激酶的催化，成为三磷酸阿糖胞苷，抑制DNA多聚酶，阻止DNA的合成；VP－16是周期特异性细胞毒性药物，作用于细胞周期S后期和G期，通过阻止细胞进入有丝分裂及抑制Ⅱ型扑拓异构酶面引起DNA链的单股性和双股性断裂。在本研究中，Western blotting结果显示化疗后Ⅱ型扑拓异构酶消失，3种药物共同作用的结果导致蛋白质包括核基质蛋白合成的减少，因此化疗后病例2，3患者白血病细胞核基质成分明显减少或消失。由于核基质与Ⅱ型扑拓异构酶的关系密切^［5］，VP-16抑制Ⅱ型扑拓异构酶从而参与影响核基质成分。由于核基质不仅是维持细胞核形态的支架，还提供许多生化反应的场所并参与其反应过程，包括DNA复制、RNA转录、基因表达等方面，代表着它可能是多种抗癌药物作用的靶位点，结合核基质部位的抗癌药物其细胞毒性会更大，与细胞伤亡有直接关系，这些可能是某些抗癌药物发挥细胞毒性作用的部分机理。

参考文献

　　1　Miller TE,Beausang IA,Winchell LF,et al.Detection of nuclear matrix proteins in serum from cancer patients.Cancer Res,1992,52:422-427.

　　2　Fey EG,Wan KM,Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold:three-dimensional organization and protein composition.J Cell Biol,1984,98:1974-1984.

　　3　Getzenberg RH,Pienta KT,Huang EYW,et al.Identification of nuclear matrix proteins in the cancer and normal rat prostate.Cancer Res,1991, 51:6514-6520.

　　4　Tew KD,Wang AL,Schein PS.Alkylating agent interactions with the nuclear matrix.Biochem Pharmacol,1983,33:3509-3516.

　　5　Nicoleta Z,Spartaco S,Andrea O,et al.Discrete localization of different DNA topoisomerases in Hela and K562 cell nuclei and subnuclear fractions.Exp Cell Res,1994,210:336-348.

(收稿：1998-01-19　　修回：1998-03-20)