¹⁴⁷Pm照射对人白血病HL-60细胞bcl-2和bax基因表达的研究

中华放射医学与防护杂志 2000年第1期第20卷 基础研究

作者：朱寿彭　肖东

单位：江苏，苏州医学院放射医学系　215007

关键词：¹⁴⁷Pm；HL-60细胞；基因表达；bcl-2；bax基因；免疫组织化学；RNA点杂交

　　【摘要】　目的　研究了¹⁴⁷Pm照射对人白血病HL-60细胞bcl-2和bax基因表达作用。　方法运用免疫组织化学技术探讨¹⁴⁷Pm对HL-60细胞bcl-2/bax的蛋白表达，以及RNA分子杂交技术探讨¹⁴⁷Pm对HL-60细胞bcl-2 mRNA的转录水平表达。结果　发现对照HL-60细胞中bcl-2蛋白呈高度表达，为88%；在¹⁴⁷Pm照射下，可下调至53%。bax在对照细胞中的表达很低；¹⁴⁷Pm作用后，未见明显改变。而受¹⁴⁷Pm照射后，可使HL-60细胞中bcl-2 mRNA表达呈明显下调，并随受照射时间的延长，下调作用更加显著。结论　¹⁴⁷Pm诱发人白血病HL-60细胞的凋亡作用，与其下调凋亡相关基因bcl-2的表达相关联。

Effect of ¹⁴⁷Pm β-irradiation on bcl-2 gene

　　and bax gene expression in human leukemia cells

ZHU Shoupeng　XIAO Dong

　　（Faculty of Radiological Medicine,Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China）

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of exposure to a pure β radiator-¹⁴⁷Pm on bcl-2 gene expression in human leukemia HL-60 cells. Methods Immunohistochemical technique was used to identify the expression of bcl-2 and bax proteins in HL-60 cells,as well as RNA dot blot hybridization to show the expression of bcl-2 mRNA in HL-60 cells. Results The expression of bcl-2 protein was as high as 88% in control human HL-60 cells. Down regulation of bcl-2 protein expression which lowered to 53% was noted after exposure to ¹⁴⁷Pm. The expression of bax protein was low in control cells, and after irradiation it did not obviously change. An obvious down regulation of bcl-2 mRNA expression was found in irradiated HL-60 cells. With increasing time of ¹⁴⁷Pm exposure, the down regulation of bcl-2 became more evident. Conclusion The apoptotic action of ¹⁴⁷Pm β-rays in human HL-60 cells is associated with the down regulation of the apoptosis-suppressing gene bcl-2.

　　【Key words】　 ¹⁴⁷Pm； HL-60 cells； Gene expression； bcl-2 gene； bax gene; Immunohistochemistry； RNA dot blot hybridization▲

　　目前，从细胞的形态学特征及DNA链断裂等方面研究，观察到重核裂变产物¹⁴⁷Pm可诱发细胞凋亡^［1］。其呈现凋亡的程度，与受¹⁴⁷Pm辐照的累积吸收剂量相关联^［2］。而通过放射自显影示踪揭示¹⁴⁷Pm在靶细胞内的行径定位，是诱发细胞凋亡的基础^［3］。为了进一步探讨¹⁴⁷Pm诱发细胞凋亡的分子机理，设计阐明人白血病HL-60细胞受¹⁴⁷Pm照射时基因bcl-2/bax蛋白表达变化^［4］，以及bcl-2 mRNA转录水平的改变。作者运用免疫组织化学技术和分子杂交技术探讨纯β射线诱发细胞凋亡和相关基因bcl-2/bax的调控，为进一步应用纯β射线的核素提供新的依据。

　　材料和方法

　　1.细胞株与细胞培养：人白血病HL-60细胞株由江苏省血液研究所提供，由苏州医学院细胞免疫研究中心传代培养。在RPMI 1640全培养液中增补体积分数为10%的灭活小牛血清，于体积分数为5%的CO₂培养器中37℃培养。实验时，取对数生长期的HL-60细胞，用PBS(pH 7.4)液洗涤两次后，再加全培养液调至实验所需的细胞浓度备用。

　　2.¹⁴⁷Pm照射细胞：收集实验用HL-60细胞，用RPMI 1640全培养液调至细胞浓度为2×10⁶个/ml。取无菌24孔培养板，在每培养孔内放置1 ml细胞悬液。然后在每一实验孔中加入1 ml用RPMI 1640全培养液稀释的7.4×10² kBq/ml ¹⁴⁷Pm (NO₃)₃工作液，从而使¹⁴⁷Pm的最终放射性浓度为3.7×10² kBq/ml。而对照组每孔加入1 ml RPMI 1640全培养液，使实验孔和对照孔的细胞最终浓度为1×10⁶个/ml。将24孔培养板放置到体积分数为5%的CO₂培养器内37℃培养，经12和24 h收集各培养标本，用于基因表达的研究。

　　3.免疫组织化学技术探讨¹⁴⁷Pm照射对HL-60细胞bcl-2/bax的蛋白表达：收集不同作用时间的¹⁴⁷Pm照射细胞及对照细胞，悬浮于pH 7.4的PBS中，使细胞浓度为2×10⁵个/ml。取经多聚赖氨酸处理后的玻片，每片滴加100 μl细胞，干燥后，用4%多聚甲醛在24℃固定10 min，然后将细胞用PBS洗涤后，与抗bcl-2鼠单克隆抗体在24℃孵育1 h。随后用0.3% H₂O₂甲醇阻断内源性过氧化物酶20 min，再用体积分数为5%的正常马血清封闭，37℃，20 min，经1∶200的ABC(avidin-biotin complex)试剂在37℃处理60 min，然后用0.04% DAB+0.03% H₂O₂显色^［6］，充分水洗后，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。阳性结果的判断标准是：镜检细胞，胞浆或胞膜出现棕褐色的为阳性细胞，随机计数高倍视野下500个细胞中阳性细胞所占的百分率，并摄片。

　　4.RNA分子杂交技术探讨¹⁴⁷Pm对HL-60细胞mRNA的转录水平表达

　　(1)总RNA的抽提：经不同时间收集¹⁴⁷Pm照射细胞和对照细胞，从细胞浓度为1×10⁷个/ml的培养细胞中抽提总RNA：即加入1 ml的Trizol (Sigma)总RNA分离试剂，混匀后，加入0.2 ml氯仿，盖管盖，振荡15 s，20℃温育3 min，在4℃ 10 000 g离心15 min，将水相转移至新管中加入等量异戊醇，置30 min，再离心，弃上清，沉淀干燥，加体积分数为75%的乙醇洗涤，充分干燥后，重溶于二乙基焦碳酸酯(DEPC，Sigma)处理过的水中，取1 μl，加DEPC稀释后，用DU-50 UV紫外线分光光度计测样品，λ=260/280 nm值的RNA样品浓度。

　　(2)RNA甲醛变性电泳确定提取RNA的纯度：取RNA样品1 μl(10 μg)，加入含甲醛、甲酰胺的加样缓冲液混合后，于60℃水浴器中变性10 min，加样至甲醛凝胶中，在50 V电压下电泳，以确定提取RNA的纯度，可见28 s和18 s条带。

　　(3)RNA点样膜：应用Hybri-Dot 1050MM 3mm孔经点样器将RNA样品10 μg点样在尼龙膜上(Boechringer Mannhein公司提供)。随即真空抽干后，取出点样膜，于真空条件下80℃烤膜2 h，保存备用。

　　(4)cDNA探针标记：实验所用bcl-2 cDNA探针，由中国科学院上海细胞生物研究所生长因子室提供。将bcl-2 cDNA探针于100℃水浴变性2 min，迅速冰上冷却，分别加入缓冲液和〔α-³²P〕dCTP 1.85 MBq进行标记。

　　(5)点杂交：将点样膜在预杂交液中浸湿，置68℃恒温水浴摇床中振荡水浴8 h，然后进行杂交：即倾出预杂交液，加入杂交液^［7］，同时加入放射性标记探针继续68℃杂交过夜，第2天分别使用2×SSC，0.1% SDS，0.2×SSC，0.1% SDS和0.1×SSC，0.1% SDS洗膜，将膜晾干后，包薄塑料保护膜，转暗室中夹压于X射线胶片增感屏暗盒中，置-70℃进行放射自显影曝光处理。

　　结　　果

　　1.¹⁴⁷Pm对HL-60细胞bcl-2/bax的蛋白表达

　　结果显示，bcl-2阳性细胞反应呈棕色，分布于胞浆、胞核膜内外。图1所示为对照的人白血病HL-60细胞，可见bcl-2蛋白呈高度表达。而在受¹⁴⁷Pm照射24 h后，观察到HL-60细胞中明显下调bcl-2的蛋白表达，见图2。而具体计数在¹⁴⁷Pm照射24 h后对HL-60白血病细胞的bcl-2和bax蛋白表达的阳性细胞率如表1所示。可见对照HL-60白血病细胞bcl-2蛋白呈高度表达，为88%；而当受¹⁴⁷Pm照射作用24 h后，观察到HL-60细胞中呈现明显下调bcl-2蛋白表达，为53%。至于bax在对照HL-60细胞中的表达就很低，只有10%，而受到¹⁴⁷Pm照射24 h后，未见到引起明显的改变。

表1　受¹⁴⁷Pm纯β射线照射24 h后的HL-60白血病

　　细胞bcl-2和bax的蛋白表达阳性细胞率

　　注：与对照组细胞比，P＜0.05

图1　免疫组织化学技术分析在对照HL-60

　　白血病细胞中的bcl-2蛋白表达

　　苏木素染色　×400

图2　免疫组织化学技术分析HL-60白血病细胞

　　在受¹⁴⁷Pm照射24 h后的bcl-2蛋白表达

　　苏木素染色　×400

　　2.¹⁴⁷Pm对HL-60细胞bcl-2 mRNA转录水平的表达

　　分别抽提了经¹⁴⁷Pm照射12和24 h的HL-60白血病细胞和相应对照HL-60细胞的总RNA，通过RNA甲醛变性电泳分析，可见28 s和18 s条带。依上述方法将bcl-2 cDNA探针进行杂交、洗膜和放射自显影操作，结果如图3所示。可见bcl-2 mRNA在对照HL-60白血病细胞中高表达，当受¹⁴⁷Pm照射12 h的HL-60细胞bcl-2 mRNA表达呈明显下调。待¹⁴⁷Pm照射持续至24 h，则其下调作用显著呈现。

图3　¹⁴⁷Pm照射HL-60白血病细胞

　　不同时间后的bcl-2 mRNA表达

　　讨　　论

　　已经实验证实，纯β辐射体核素¹⁴⁷Pm可诱发白血病细胞凋亡：揭示了¹⁴⁷Pm可诱发细胞核断裂和核固缩，以及凋亡小体和DNA核小体梯状谱形成的凋亡特征。细胞凋亡是细胞针对所处环境因素的特定改变所产生的应答，是一种程序化死亡过程^［8］，它与细胞生长一样，在机体中承担着重要的调控作用。在本课题的研究中，进而探讨了¹⁴⁷Pm的照射作用对人白血病HL-60细胞bcl-2和bax基因表达的变化与细胞凋亡的相关。设计运用免疫组织化学技术探讨了¹⁴⁷Pm照射对人白血病HL-60细胞bcl-2和bax蛋白表达，以及通过RNA分子杂交技术探讨了¹⁴⁷Pm照射对HL-60细胞bcl-2 mRNA转录水平的表达。发现纯β核素¹⁴⁷Pm能使HL-60细胞bcl-2蛋白表达明显下调。与此同时，经Dot blot点杂交分析表明，¹⁴⁷Pm又可使HL-60细胞bcl-2 mRNA表达明显下调。由此可见，由¹⁴⁷Pm照射所诱发的白血病细胞凋亡作用与其下调bca-2蛋白表达和bcl-2 mRNA表达的基因调控相关联。■

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470389)

　　参考文献

　　［1］朱寿彭，张澜生，傅强.¹⁴⁷Pm诱发免疫细胞凋亡的电镜观察及CHX和Act D的防护作用.辐射防护，1998，18：134-138.

　　［2］Zhu Shoupeng,Zhang Lansheng,Fu Qiang. Apoptosis in cells induced by fission fragment ¹⁴⁷Pm. Nucl Sci Tech,1997,8:229-232.

　　［3］朱寿彭，张澜生，傅强.荧光显微镜及放射自显影观察¹⁴⁷Pm诱发细胞凋亡.核技术，1997，20：663-666.

　　［4］Lotem J,Sachs L. Regulation of bcl-2 and bax in the control of apoptosis by hematopoietic cytokines and dexamethasome. Cell Growth Differ,1995,6:647-653.

　　［5］Sakakura C,Sweeney EA,Shirahama T,et al. Suppression of bcl-2 gene expression by sphingosine in the apoptosis of human leukemic HL-60 cells during phorbol ester induced terminal differentiation. FEBS Lett,1996,379:177-180.

　　［6］Larocca LM,Teofili L,Sica S, et al. Quercetin inhibits the growth of leukemic progenitors and induces the expression of transforming growth factor-β₁ in these cells.Blood,1995,85:3654-3661.

　　［7］朱寿彭.浓缩铀的放射毒理.北京：原子能出版社，1998.140-143.

　　［8］Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell,1997,88:353-365.

收稿日期:1999-04-01