白血病细胞多药耐药细胞系的建立及白细胞介素4对其多药耐药的逆转研究

中华儿科杂志 2000年第10期第38卷 论著

作者：付劲蓉　李成荣　杨锡强　王莉佳

单位：付劲蓉（510000深圳市儿童医院）；杨锡强（400014　重庆医科大学附属儿童医院免疫实验室）；王莉佳（400014　重庆医科大学附属儿童医院免疫实验室）；李成荣（深圳市儿童医院）

关键词：白细胞介素4；白血病；HL-60细胞；抗药性，多药

　　 　　【摘要】　目的　研究重组人白细胞介素 4(IL-4)对人白血病细胞（HL-60）多药耐药(MDR)的逆转作用及可能机制。 方法　采用长期、间隔、单一、小剂量用药的方法诱导HL-60细胞系成为MDR细胞长春新碱(VCR)系HL-60/VCR,建立 MDR细胞模型;以流式细胞仪间接免疫荧光染色检测HL-60、HL-60/VCR及 IL-4处理的HL-60/VCR细胞中 p-糖蛋白(p-gp)表达 ;四氮甲基唑蓝 (MTT)生物活性法及荧光分光光度法检测上述各种细胞对VCR、阿霉素（14-羟柔红霉素,ADM）、柔红霉素(DNR)、足叶乙甙(VP-16)等化疗药物的敏感性及ADM在肿瘤细胞中的聚集量。 结果　HL-60/VCR细胞中p-gp呈高强度表达 ，阳性率为（95.4±1.5）％，较HL-60细胞［p-gp表达阳性率仅（1.5±0.5）%］差异有显著性 (n=10, t=62.5, P＜0.01);IL-4处理的 HL-60/VCR细胞株中的 MDR 瘤细胞 p-gp表达 降低 ［处理48 h p-gp表达降至（11.3±2.9）％］，增加化疗药物的细胞内聚集量，恢复MDR细胞的药物敏感性,(耐药逆转倍数 可达3.0),此作用可被蛋白激酶C(PKC)激活剂——佛波酯 100 ng/ml完全阻断。结论　长期、间断、单一、不足量的化疗可导致 MDR；IL-4 可通过抑制肿瘤细胞的 p-gp表达，增加化疗药物在肿瘤细胞内的聚集而逆转白血病细胞的MDR，此作用可能与抑制 PKC的活性有关。

Establishment of multi-drug resistant cell line HL-60/VCR and the reversal of multidrug resistance by interleukin-4

FU Jinrong　LI Chengrong　YANG Xiqiang

　　（Department of Immunology Children's Hospital, Universty of Medical Sciences, Chongqing 400014, China）

　　 　　【Abstract】　Objective　To investigate the reverse effect of interleukin-4 (IL-4) and its mechanism in multidrug-resistance (MDR) of human leukemic cells. Methods　A long-term, intemittent, singular, uneffcient vincristine was added step by step into the culture medium of tumor cells to induce human promyeloid leukemia cell line HL-60 into multi-drug resistant cell line HL-60/VCR; MTT assay was used to detect the sensitivity of these tumor cells to all sorts of chemotherapeutic agents such as VCR, Adriamycin (ADM), mitomycin(MMC) and etoposide (VP-16). Indirect immunofluorescence staining by flow cytometry was used to evalue the expression of p-glycoprotein (p-gp), which is one of the main multi-drug resistant protein in tumor cells. Microquantitative analysis by fluorometer was employed to detect the intracellular accumulation of ADM. Results　Over expression of p-gp (the positive rate of p-gp expression was 95.4%) was found in HL60/VCR cells while the p-gp could only be detected in 1.5% of HL-60 cells, the difference was significant (n=10, t=62.5, P＜0.01). HL-60/VCR treated with interleukin-4 could decrease the expression of p-gp (the positive rate of p-gp expression was down to 11.3% after 48 hours) and the quantity of intracellular accumulation of ADM was greatly increased. At the same time, the HL-60/VCR cells became again sensitive to all the above agents, the reversal index (RI) was 3.0. These effects could be inhibited by 100 ng/ml 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), which is an activator of protein kinase C(PKC). Conclusion　The treatment of leukemic cell with a longterm, intermittent,singular, unefficient chemotherapeutic agents could induce multi-drug resistant cells. Interleukin-4 can reverse the multi-drug resistance by inhibiting the expression of p-gp and increasing the quantity of intracellular chemotherapeutic agents in tumor cells. The effects were probably related to the inhibition of the PKC activity.

　　【Key words】　Interleukin-4;　Leukemia; HL-60 cells;　Drug resistance, multiple

　　人白细胞介素4 (IL-4)具有抑制人白血病细胞(HL-60)增殖、诱导分化、激发机体抗肿瘤免疫反应等作用，在辅助治疗白血病中具有较好的应用前景^［1］。本研究建立人HL-60多药耐药(MDR)模型，初步探讨 IL-4 是否能逆转MDR及可能机制，为临床用 IL-4辅助治疗白血病提供理论依据。

　　材料和方法

　　一、细胞株

　　本室的人早幼粒HL-60按常规传代培养于 RPMI1640的培养基,加入体积比为10％的新生小牛血清(GIBCO)。

　　二、药物

　　长春新碱(VCR，购自上海华联制药有限公司)，速溶型阿霉素［14-羟柔红霉素（ADM）购自意大利爱宝大药厂］，丝裂霉素［自力霉素（MMC）购自美国Sigma公司］，威猛鬼臼噻吩苷(Vm-26,系美国Bristol myter squibb生产），鬼臼乙叉甙(足叶乙甙（VP-16）购自连云港制药厂），柔红霉素(DNR ，系意大利 Farmitaliu carlo evba公司生产)，重组人IL-4(购自北京邦定公司），佛波酯( TPA，购自美国Sigma公司）。

　　三、细胞培养及耐药株HL-60/VCR 的建立

　　取对数生长期的HL-60细胞（1×10⁴/ml）,加 0.01 μg/ml VCR培养72 h，用 RPMI1640培养液洗净后，再培养至细胞生长恢复正常，提高VCR浓度1倍。如此反复，经 5个月诱导，最终获得耐受40 μg/ml VCR 的HL-60/VCR，维持培养于含 VCR 10 μg/ml的培养液中，每2～3 d传代 1次用于实验。

　　四、细胞耐药性试验

　　采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)生物活性检测法^［2］。分设以下 4组：(1)化疗药物与IL-4同时加入培养液组。(2)IL-4预处理2 d ,再加入化疗药物组。(3)TPA 组：用化疗药物处理前 2 d 加入TPA 100ng/ml。(4)TPA纠正组： IL-4和TPA 100 ng/ml同时加入预处理细胞2 d。除第3组外,上述各组细胞分别加入0、50、100、200、500 、1 000 U/ml的IL-4及各种不同浓度的化疗药物。耐药倍数(resistant factor,RF)＝IC ₅₀　(HL-60/VCR)/IC₅₀(HL-60)；逆转倍数(reversal index,RI)＝不加IL-4时的IC₅₀/加IL-4的IC₅₀，其中IC₅₀为半数抑制浓度。

　　五、p-糖蛋白(p-gp)的流式细胞仪( FACS)检测

　　采用间接免疫荧光染色法，FACS（ Calibur,美国BD)分析检测。所用鼠抗人p-gp单克隆抗体（C219）购自福州迈新公司。用相应IgG亚类的无关抗体为第二抗体作为对照。

　　六、细胞内ADM含量测定

　　用RF-520荧光分光仪检测，以ADM抽提液调零，0.1 μg/ml的ADM标准品扫描，确定测定参数得激发波长(λexit)＝473 nm ，发射波长(λexit)＝555 nm，窄缝＝20 nm，据标准曲线和待测查品的RF值，求出细胞 ADM的聚集量。

　　七、统计学处理

　　结果的数据采用 t、 F检验、直线相关分析。

　　结果

　　一、耐药谱

　　HL-60/VCR对ADM、MMC、VP-16、Vm-26、VCR、DNR 6种抗肿瘤药物的IC₅₀见表1，显示HL-60/VCR除对原诱导药物具有耐受性外，对其他5种药物也具有交叉耐药性，即表现出MDR。

表1　6种HL-60和化疗药物对 HL-60/VCR 细胞的

　　半数抑制浓度和耐药倍数(±s, μg/ml， n=10)

　　注：VCR: 长春新碱，ADM：14-羟柔红霉素，Vm-26:威猛鬼臼噻吩苷，Vp-16:足叶乙甙，DNR:柔红霉素，MMC:红裂霉素（下表同）

　　二、IL-4对HL-60/VCR MDR 的逆转作用

　　化疗药物与IL-4同时加入到肿瘤细胞中，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性稍有增加，但不明显，RI接近于 1 。TPA(100 ng/ml) 本身无药物增敏作用，与IL-4同时加入可完全阻断IL- 4 对 HL-60/VCR的耐药逆转作用(表2)。IL-4(浓度大于或等于100 U/ml）预处理 2 d后再加化疗药物，肿瘤细胞对药物敏感性明显增高，RI可达3.0(表3)，经F检验，随IL-4浓度不同耐药倍数差异有显著性，以2 000～5 000 U/ml时逆转作用最强。

　　三、IL-4对p-gp表达的影响

表2　IL-4及TPA对HL-60/VCR耐药性的

　　逆转倍数(±s, n=10)

　　注：1 ：IL-4 2 000 U/ml与化疗药物同时应用，2: IL-4 2 000 U/ml作用2 d后再加相应化疗药物，3: TPA 100 ng/ml作用2 d后再用化疗药物处理，4: 2+3。 ^*　与1相比，P＜0.01

表3　不同浓度的IL-4和化疗药物对HL-60/VCR 耐药倍数的影响(±s，n=10)

　　注： 经F检验,随IL-4浓度不同耐药倍数有显著差别,其中以IL-4浓度为2 000～5 000 U/ml时逆转作用最强

表4　肿瘤细胞内ADM聚集量［±s, μg/(ml*10⁶细胞), n=6］

　　^*?P＜0.05　　FACS检测显示HL-60细胞p-gp表达为（1.5±0.5）%，而 HL-60/VCR p-gp阳性率高达（95.4±1.5）%,两者相比差异有非常显著性(n=10,t=62.50,P＜0.01)。HL-60/VCR细胞经IL-4处理24 h后p-gp表达阳性率降至（7.3±2.7）%(n=10，t=34.90，P＜0.01)，48 h以后仅为（11.3±2.9）％。IL-4浓度在100～500 U／ml 范围内与p-gp表达无显著相关( r=-0.54, n＝5，P＞0.05)。

　　四、 IL-4增加ADM在细胞内的聚集

　　加入相同浓度ADM至肿瘤细胞培养中，可见HL-60/VCR细胞内药物含量明显低于 HL-60细胞，IL-4 (2 000 U/ml)处理2 d后 HL-60/VCR细胞内药物浓度升高，并接近正常HL-60 细胞(表4)。

　　讨论

　　化疗在白血病治疗中占有重要地位，然而MDR 的存在及大剂量常规化疗对机体免疫及骨髓功能的损害可使化疗失败。本实验结果与临床观察到的不规则、单一用药可诱导MDR 的现象相符合。MDR 的产生主要与p-gp 的过度表达有关。p-gp为一能量依赖性药泵，能将多种结构和作用机制不同的药物排出细胞外，因而产生MDR。本研究HL-60/VCR细胞株在获得多药耐药性的同时，细胞膜上的p-gp呈过度表达，支持 p-gp 与MDR 有关的理论。目前,逆转MDR的研究已成为肿瘤治疗的热点和难点，实验及临床虽已证明多种药物，如环胞菌素A等可逆转MDR，但这些药物达到有效逆转剂量时有时可引起严重副作用，因此迫切需要开发毒性小、逆转作用强的MDR逆转剂^［3］。

　　IL-4的抗瘤效应已为人们所认识^［4］。我们发现，在IL-4浓度大于或等于100 U/ml时,可增强HL-60/VCR HL-60细胞对多种药物的敏感性及化疗药物在细胞内的聚集量。IL-4加入至发挥效应的时间约需2 d，此与FACS检测到的 p-gp表达降低时间相吻合，提示IL-4可能通过抑制p-gp表达而逆转MDR。

　　关于p-gp的表达调控机制尚未完全阐明，人的p-gp由多药耐药基因(MDR1)编码，与细胞增殖有关的基因调节MDR1的表达^［5］，而p-gp则可能是PKC作用的基质。既往研究发现，IL -4抑制肿瘤细胞增殖可能与诱导合成PKC抑制物有关^［6］。本研究发现PKC激活剂TPA 可消除IL-4的耐药逆转作用，提示 IL-4逆转 MDR与抑制PKC活性有关。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470733)

参考文献

　　1，Hassan HT, Grell SB, Danso U, et al. Interleukin-4 inhibits proliferation of human leukemic megakaryoblast cell line MHH225. Hematol Oncol, 1994, 12:61-66.

　　2，Pieters R, Huismans DR. Comparison of the rapid automated MTT-assay with a dye exclusion assay for chemosensitivity testing in childhood leukemia. Br J Cancer, 1989,59:217-220.

　　3，曹世龙,主编. 肿瘤学新理论与新技术. 上海:上海科学技术教育出版社，1997.437-456.

　　4，刘振华,主编. 肿瘤预后学.北京：科学技术文献出版社，1995.119-120.

　　5，Roberts TM. A signal chain of events. Nature, 1992, 360:534.

　　6，Dave S, Marienelle B, Edward O, et al. Modulation of human melanoma cells by interleukin-4 and in combination with γ - interferon of α-tumor necrosis factor. Cancer Res, 1991, 51:2002-2008.

收稿日期：1999-10-30