多重PCR检测急性淋巴细胞白血病p16基因纯合缺失及其临床意义

癌症 1999年第4期第18卷 临床研究

作者：许多荣　洪文德　郑冬　童秀珍　罗绍凯

单位：中山医科大学附属第一医院血液科(广州，510080）

关键词：p16基因；多重半定量PCR；急性淋巴细胞性白血病

　　【摘要】目的：探讨p16基因纯合缺失与急性淋巴细胞白血病的关系及其临床意义。方法：采用半定量多重PCR检测了42例急性淋巴细胞白血病(ALL)病人p16基因纯合缺失情况，结果：35.7％(15/42)的ALL病人出现了p16基因纯合缺失，p16基因纯合缺失的ALL在临床上主要表现为外周血白细胞计数高、骨髓中幼稚细胞百分比高、多个器官易受累、风险因素高、治疗效果差，但与性别,年龄关系不大。部分病人p16基因纯合缺失还随病情改变呈间歇性变化,结论：检测p16基因纯合缺失有助于判断ALL病人的恶性程度、病情变化和治疗效果。

　　中图分类号：R733.71　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)04－0454－03

The detection of homozygous p16 gene deletions in acute lymphoid leukemias by semiquantitative multiplex polymerase chain reaction and it's clinical significance

XU Duo－rong，HONG Wen－de，ZHENG Dong，et al.

　　【Abstract】Objective：To study the relation－ship between homozygous deletions of p16 gene and acute lymphoid leukemia and it's clinical significance.Methods：A semiquantitative multiplex polymerase chain reaction assay was used to detect homozygous deletions of p16 gene in 42 ALL patients.Results：Thirty five point seven percent (15/42) of the patients were found with homozygous deletions of p16 gene.All patients with homozygous p16 gene have higher WBC in peripheral blood,higher percentage of blast cells in bone marrow,higher risk factor and poorer response to treatment,but it had no relation with age and sex.Part of ALLs with homozygous deletions of p16 gene had also alteration with the development of disease.Conclusion：Detection of homozygous deletions of p16 gene can be used for judging the malignant degree， development of disease and effect of treatment in partial ALL cases.

　　Key words：p16 genes； Semiquantitative multiplex polymerase chain reaction (PCR); Acute lymphoid leukemia (ALL)

　　1　引言

　　p16基因是1994年发现的一个新的抑癌基因^[1],位于9P21甲硫基腺苷磷酸化酶(MATP)和INFa基因之间^[2]。全长8.5Kb,含3个外显子和2个内含子，其主要功能就是其编码的p16蛋白竞争性结合细胞周期素依赖性激酶(CDK)，抑制Rb蛋白磷酸化，控制细胞过度从G1期进入S期^[3]。p16基因纯合缺失与ALL的关系国外已有报道，但国内报道较少且多数采用Sothren杂交方法。本文采用多重半定量PCR研究了42例ALL病人的p16基因纯合缺失情况及其与疾病的临床关系，以期从分子生物学水平探讨ALL的发病机制。

　　2　材料和方法

　　2.1　材料

　　本组42例ALL病人，男性28例，女性14例，平均年龄33.6岁。12名正常人，男性7例，女性5例。平均年龄31.6岁。K562细胞株为p16基因纯合缺失,作为纯合缺失的阳性对照。引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。见表1。

表1　不同基因外显子的引物序列

　　 2.2　方法

　　2.2.1　取骨髓3ml或外周血5ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液离心收集单个核细胞(MNC),常规方法提取DNA，并进行浓度和纯度测定。

　　2.2.2　半定量多重PCR：将E1或E2引物和E4引物放在一个体系中进行多重PCR扩增。反应总体积50μl，聚合DNA酶1.5u，DNA200ng，E1、E2、E4引物量分别为25pmol、25pmol、50pmol.PCR循环条件：E1＋E4：94℃1min，58℃1min,72℃1.5min;E2＋E4：94℃1min,56℃1min,72℃1.5min,两者都为35个循环。DNA扩增产物先经2％琼脂糖电泳、紫外灯下摄象，再送薄层扫描仪扫描，测出两条产物带的光密度，计算比值。以3倍K562细胞DNA和1倍正常人细胞DNA混合扩增结果作标准值，评价其它病例，判断方法参照国外Si11方法^[4]。

　　2.2.3　白血病化疗疗效判断标准参照国内疗效标准^[5]

　　2.3　统计学分析

　　采用四格表χ²检验和四格表确切概率计算法。3　结果

　　3.1　判断p16基因纯合缺失标准值的设计及结果

　　本实验选用p16基因纯合缺失的细胞株K562和12例正常人细胞的DNA(按3∶1比例)进行多次混合扩增，PCR扩增产物经扫描测得的平均值为₁(OD1/OD4)=1.1716±0.0913，₂(OD2/OD4)=1.1680±0.0841，如果在恶性血液病病例中，测得的OD1/OD4(OD2/OD4)比值小于₁(₂)，则可认为是p16基因外显子1(外显子2)纯合缺失。(OD1、OD2、OD4分别代表E1、E2、E4扩增产物的扫描值)

　　3.2　正常人和急淋病人p16基因纯合缺失的检测结果(见图1)

图1　部分ALLp16基因外显子2多重PCR扩增产物电泳图

为9例ALL病人琼脂糖电泳图，扩增产物中出现两条带，第一条带为E4扩增产物，长度为273bp，第二条带为E2扩增产物，长度分别为393bp。其中2、3、9三例病人第二带明显减弱或消失，OD2/OD4比值均＜2,则可认为这三例病人属p16基因外子2纯合缺失。

　　12例正常人中无外显子1和外显子2纯合缺失，42例ALL病人中有15例发生p16基因纯合缺失，且外显子1和外显子2同时发生缺失，ALL组与正常人组比较差异有显著性(P＜0.05)。

　　3.3　p16基因纯合缺失的ALL病人临床特征

　　在本组42例ALL病人中，缺失组15例＜18岁者5例，＞18岁10例；男性9例，女性6例；外周血白细胞＜5×10⁹/L者5例，＞5×10⁹/L者10例；骨髓(原＋幼)＜60％者2例，＞60％13例；风险因子^[6]＜0.8者3例，0.8者12例；有9例病人出现髓外侵犯。在27例不缺失组中，＜18岁者7例，＞18岁20例；男性16例，女性11例；外周血白细胞＜5×10⁹／L者21例，＞5×10⁹／L者6例；骨髓(原＋幼)＜60％者19例，＞60者8例；风险因子＜0.8者17例，＞0.8者10例；只有2例病人出现髓外侵犯。缺失组与不缺失组比较在年龄、性别上无明显差异，但缺失组病人外周血白细胞计数、骨髓幼稚细胞百分比、风险因子均明显高于不缺失组，且临床上表现为多个器官易受累。

　　3.4　p16基因纯合缺失的ALL治疗结果

　　42例ALL中有5例病人失访，只观察到37例病人治疗后结果，各病人首次化疗方案均为“VAP”，其与p16基因的关系见表2。

　　表2　p16基因与ALL治疗反应的关系

　　3.5　p16基因纯合缺失与病情进展的关系

　　在15例缺失的ALL病例中，有4例治疗后CR的标本(No1、No4、No8、No14)p16基因重新出现。对这4例病人进行追踪观察发现，No1、No4、分别在复发前1、2个月，No8、在复发后p16基因可重新发生缺失，No14、尚未复发，仍在随访之中。3　讨论

　　3.1　p16基因纯合缺失在ALL中的发生率

　　自1994年发现p16基因以来，在血液系统恶性肿瘤中，有更多的报道支持p16基因缺失在ALL中频发。综合各组资料报道p16基因纯合缺失在ALL中总阳性率约为36％^[7]，本实验缺失率为35.7％(15/42)，与其他作者结果基本相似，p16基因纯合缺失在ALL中有较高的发生率，其机理尚不清楚，目前主要认为：在淋巴细胞中可能存在某些内在机制，如DNA重组酶活性增强，这些特殊机制能促使p16基因(或P21区)易于在细胞永生化或转化过程中发生缺失或重组。

　　3.2　p16基因纯合缺失与ALL的临床特征

　　国外虽然对p16基因作了一些研究，但大多数只局限于基础理论的研究，p16基因纯合缺失与疾病临床关系报道却较少。本实验42例ALL病例中p16基因缺失与不缺失在年龄和性别上无显著差异，但p16基因缺失的病人在临床上主要表现为外周血中白细胞计数高、骨髓中幼稚细胞百分含量高、多个器官易受累、风险因素大。p16基因缺失的ALL有较高的恶性度，目前主要认为由于p16基因缺失的ALL患者体内缺乏p16蛋白，不能抑制cyc1in－CDK复合体形成，使cyc1in－CDK复合体活性增强，促使Rb蛋白磷酸化，肿瘤细胞DNA合成加速，细胞增殖加快，其恶性度就增高。1995年Seisho^[8]作类似的研究，发现除上述特征外，p16基因纯合缺失还与病人出现纵膈肿块有关，他报道，缺失组有纵膈肿块者占48％，而不缺失组只有2％的病例出现纵膈肿块，但缺失组与不缺失组在年龄上也未发现差异。但Zhuo^[9]报道儿童ALL中出现了更高的阳性率。本实验中大多数标本来自成人ALL。

　　3.3　p16基因纯合缺失与ALL治疗反应的关系

　　本组42例ALL中，共收集到37例化疗(1～3个疗程)后的骨髓报告，其结果，16例CR、7例PR、14例NR，总的完全缓解率为43.2％，总有效率为66.2％。其中，p16基因缺失组有效率为40.0％，而不缺失组有效率为77.3％。不缺失组的有效率明显高于缺失组，两组之间有显著性差异(P＜0.05)。此结果表明p16缺失的ALL对治疗不敏感，反应差。这种较差的治疗效果主要与其恶性程度高有关。

　　3.4　p16基因纯合缺失与ALL病情进展关系

　　在15例缺失的ALL病例中，No7、No11、No13、No15、4例病人未能收集到其治疗后标本，所以只对其余11例作了治疗后p16基因检测，结果发现：4例取得CR时的标本(No1、No4、No8、No14)p16基因重新出现，其余7例p16基因仍缺失，对这4例取得CR的病人进行追综观察发现，No1、No4在取得完全缓解12、8个月时，骨髓中的幼稚细胞含量分别只有7％和11％，而检测p16基因已示缺失。继续随访发现，No1在1个月后复发，No4在2个月后也复发。No8是在复发后获得其骨髓标本，作p16基因检测也示缺失。No14尚在随访之中。以上资料表明部分急淋病人p16基因可在初诊时缺失，取得完全缓解后重新出现，复发时又丢失。这一现象提示p16基因缺失呈间歇性变化^[10]，这一变化的机制目前尚不清楚，需要进一步研究。但利用p16基因呈间歇性变化的这一特点，在临床上，可用p16基因纯合缺失作为判断部分ALL病人病情进展的监测指标。

　　参考文献

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　　9　Zhou M,Gu L, James CD, et al. Homozygous deletions of the CDKN2(MTS1/P16INK4) gene in cell lines established from children with acute lymphoblastic leukemia [J] .Leukemia,1995,9(3)：1159～1161.

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收稿日期：1998－07－27；修回日期：1999－04－12