免疫荧光双标记监测白血病微小残留病临床研究

临床血液学杂志 1999年第5期第12卷 论著

作者：谢晓宝　华铮　邱国强　严峰　华晓莹

单位：常州市第一人民医院血液科*

关键词：白血病，急性；微小残留病；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；流式细胞术

　　摘要　目的：观察TdT及系列相关抗原双标记在急性白血病细胞中的表达及其在预测白血病复发过程中的作用。方法：采用免疫荧光双标记技术，配合流式细胞术检测急性白血病细胞的TdT及系列相关抗原双标记及急性白血病完全缓解后免疫双标记抗原变化。结果：64例急性白血病中免疫双标记表达36例(56.25%)，其中32例ALL全部表达免疫双标记，32例AML仅有4例表达(12.5%)，在12例获CR的表达免疫双标记的急性白血病中，4例免疫双标记细胞占单个核细胞0.01%～0.08%，并有长期缓解，而8例免疫双标记细胞占单个核细胞1.5%～95.38%的急性白血病，均于近期骨髓复发。结论：免疫荧光双标记技术在部分急性白血病的微小残留监测中具有一定的临床意义。

The Application of Double Color Immunofluorescence To Monitoring Leukemic Minimal Residual Disease

Xie Xiaobao,Huazhen,Qiou Guoqiang et al

　　The First People′s Hospital of Changzhou,Jiangsu,2130003

　　Abstract　Objective:To observee the coexpresson of TdT and lineage-associated antigens by acute leukemia and their implication in monitoring the relapse of acute leukemia.Method:The double color of immunofluorescence in cojunction with flow cytometry.Result:In 64 patients with acute leukemia,36 patients coexpressed TdT and lineage-associated antigens accounging for 56.25%.32 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) coexpressed TdT and lineage-associated antigens whereas only 4 in 32 patients coexpressed antigens mentioned above accounting for 12.5% In 12 patients obtaining CR who expressed antigens mentioned above,4 patients expressed 0.01～0.08 percentage of those antigens and experienced continue CR.Othetr 8 patients expressed 1.5～95.38 percentage of those antigens showed bone marrow relapse after a short period of CR.Conclusion:TdT and lineage-associated antigens are expressed mainly by ALL,and may be applied to monitoring leukemic MRD.

　　Key words　Acute leukemia　Minimal residual disease　TdT　Flow cytometry

　　白血病微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)是指白血病完全缓解后体内残留少量白血病细胞的状态。临床白血病患者完全缓解后MRD的监测对指导治疗有利，对选择强化治疗时机、化疗强度和维持治疗的时间等都有重要的参考价值，对提高白血病缓解率及长期无病生存期有很大的临床意义。目前白血病MRD监测手段发展迅速，已有多种方法应用于临床。本文采用敏感的流式细胞术免疫荧光双标记技术对白血病MRD进行监测，取得较满意的临床效果，现报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象　64例急性白血病均为本院1996年5月～1998年6月住院或门诊病人，其中急性髓细胞性白血病(AML)32例，T淋巴细胞系列急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)8例，B淋巴细胞系列急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)24例。年龄6～51岁，男38例，女26例。治疗以标准联合化疗方案为主，AML以DA、HA方案，ALL以DOLP方案，巩固化疗前者用DA、HA、MA等，后者用DOLP、HDMTX等方案。临床完全缓解标准参见全国白血病化疗讨论会(1987年苏州)。

　　1.2　单克隆抗体　HTdT-1，3，4(抗-TdT)为Immunotech产品，L17F12(抗-CD₅)，4H9(抗-CD₇)，4G7(抗-CD₁₉)，L₂₇(抗-CD₂₀)，L₁₃₈(抗-CD₁₃)，P_67.7(抗-CD₃₃)，W₈E₇(抗-CD₁₀)，My₁₀(抗-CD₃₄)均为Becton Dickinson产品。

　　1.3　检测方法　标本来源为患者外周血。采用流式细胞仪(Facscalibur,Becton Dickinson,USA)，应用免疫荧光标记技术对白血病外周血单个核细胞(MNC)进行免疫分型。随后以抗-TDT单克隆抗体与系列相关抗原之单克隆抗体进行免疫双标记检测。MNC调至2×10⁵个/L，加20 μl系列相关单克隆抗体(抗-CD₁₉-PE，抗-CD₅-PE，抗-CD₃₃-PE)，4℃暗处30 min，取出洗涤3次，0.1% Triton 100 2 ml混均，4℃ 5 min洗涤3次，加20 μl抗-TDT-FITC放置4℃ 1 h，洗涤后上机检测，检测10 000个MNC，同时设置阴性对照管，阳性细胞≥20%者为阳性标准。

　　2　结果

　　2.1　TDT加系列相关抗原免疫双标在急性白血病中表达　64例急性白血病中免疫双标记表达36例(56.25%)，其中32例ALL全部表达免疫双标记，8例T-ALL阳性MNC为67.08±22.88%(±s，下同)，24例B-ALL阳性MNC为62.61±24.57%。32例AML中4例表达免疫双标记(12.50%)，阳性MNC为47.53±14.28%。由此可见TdT加系列相关抗原免疫双标记表达主要发生在ALL，见表1。

　　2.2　联合化疗对免疫双标记表达的影响　表达免疫双标记的急性白血病36例，经联合化疗1～3个疗程达完全缓解12例，其中4例免疫双标记细胞比例下降明显为0.01%～0.08%，其余8例残留较多的免疫双标记细胞1.56%～95.38%，见表2。由此将前者归类于“MRD阴性”急性白血病，后者且称为“MRD阳性”急性白血病。

表1　TdT加系列相关抗原免疫双标记在急性白血病中的表达

表2　急性白血病CR前后免疫双标记细胞变化

　　2.3　联合化疗后免疫双标记细胞数与患者预后的关系　随访2～24个月，结果“MRD阴性”组4例均呈持续完全缓解，而“MRD阳性组”8例分别于完全缓解后2～9个月骨髓象复发。

　　3　讨论

　　目前，急性白血病完全缓解的标准为骨髓象中原始细胞加幼稚细胞或早幼粒细胞数≤5%。现有的MRD检测方法中FCM免疫荧光标记技术以其简单、快捷和敏感度高而备受人们重视。Drach^〔1〕共检测77例急性白血病TdT的表达，32例急性淋巴细胞白血病全部表达，而45例急性粒细胞白血病表达7例(15.6%)。本研究所检测的包括TdT的免疫双标记白血病阳性表达与之相似，ALL全部表达，而AML表达率12.5%，可见ALL细胞表达TdT较ALL比例高。急性白血病经联合化疗后其血象和骨髓象中白血病细胞基本消失，而经细胞表面及胞核内抗原表达分析可见部分白血病异常细胞并未完全消失。Ching-Hon Pui^〔2〕认为免疫荧光双标记分析是一种敏感的检测MRD方法，可以检测出＜10^-4个白血病细胞。本文8例急性白血病CR后外周血单个核细胞中仍残留较大比例的免疫双标记细胞，此组患者均于近期复发，而另一组免疫双标记细胞比例较少者CR时间长，说明免疫双标记细胞的监测更有利于判断患者体内白血病细胞状态，为联合化疗、骨髓移植提供了更有利的指导依据。但急性白血病出现免疫双标记表达的机率在本研究中只占56.25%，尤其AML表达率低，故应结合其他MRD检测手段更全面地对急性白血病MRD进行监测。

　　*邮政编码：江苏常州，213003

　　参考文献

　　　［1］　Drach J,Gattringer C,Huber H.Combine flow cytometric assess ment of cell surface antigen and nuclear Tdt for the dletection of minimal residual disease in acute leukemia.Brit J.Haematol.1991,77:37～42

　　［2］　Ching-Hon Pui,G.Frderick,Behm ,et al.Clinical and biologic relerance of immunologic marker studies in acute lymphoblastic leukemia. Blood，1993,82:343～362

1999-03-29 收稿