周期蛋白D在小儿急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞中的表达及意义

中华儿科杂志 2000年第2期第38卷 论著摘要

作者：李静　张乐萍　薛卫成

单位：李静（100044　北京医科大学人民医院儿科　现在100730北京协和医院儿科)；张乐萍（100044　北京医科大学人民医院儿科）；薛卫成（100044　北京医科大学人民医院病理科）

　　细胞周期中存在节点(check point),对细胞周期起重要调控作用,其中最重要的一个节点位于G₁期,称为起始点(START) 。周期蛋白D作为细胞周期 G₁期的主要正性调节因子，可以推动细胞进入S期。已证实其过度表达可促使细胞越过节点的控制,并与多种恶性肿瘤有关^［1］。目前的研究主要限于对周期蛋白D₁和实体瘤的研究。本实验检测了30例小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)中3种周期蛋白D(D₁、D₂和D₃)的表达,并分析其与临床特征的关系。

　　材料及方法

　　1.标本：30例ALL病例按FAB标准诊断,并经免疫分型证实。其中男19例,女11例；年龄1～14岁。于诱导缓解前进行骨髓穿刺。以10例非白血病儿童的骨髓作为正常对照。

　　2.试剂：周期蛋白D单克隆抗体: cyclin D₁ Ab(clone DCS-6)、 cyclin D₂ Ab (clone DCS-3.1)及cyclin D₃ Ab (clone DCS-22)均为美国NeoMarkers公司产品。SAP试剂盒为美国Vector公司产品。

　　3.免疫组化染色：骨髓涂片经丙酮-20℃固定5 min,乙醇-20℃后固定3 min。经正常马血清封闭20 min后,加一抗(1∶50)过夜。按SAP法免疫组化染色,BCIP/NBT显色,甲基绿衬染。封片后在光镜下观察,细胞核内见到紫兰色颗粒沉着为阳性细胞,阳性率≥5%者计为阳性结果^［2］ 。用 PBS代替一抗作为阴性对照。

　　4.统计学处理：四格表精确概率法

　　结果

　　正常对照3种周期蛋白D表达均阴性,30例小儿ALL中周期蛋白D₁、D₂和D₃过度表达阳性率分别为7%(2/30)、0(0/30)和47%(14/30) 。

　　周期蛋白D₃过度表达在WBC＞25×10⁹/L组阳性率为77%,在WBC＜25×10⁹/L组阳性率为24%,两者的差异有非常显著意义。高危型患儿阳性率为69%,普危型患儿阳性率21%,两者差异有显著意义。在年龄≥10岁患儿阳性率为73%,年龄＜10岁患儿阳性率为32%,两者差异无显著性。浸润体征阳性的患儿周期蛋白D₃阳性率为70%,浸润体征阴性组阳性率为35%,两者差异无显著性 。在T-ALL和B-ALL两者差异无显著性(表1)。

表1　周期蛋白D₃的表达与小儿ALL临床特征的关系

　　注：^*肝、脾＞5 cm或淋巴结肿大,直径＞2 cm讨论

　　G₁期是细胞分裂周期中的主要限速阶段,因此其调控异常与肿瘤发生的关系日益受到关注。周期蛋白D包括周期蛋白D₁、D₂和D₃三个亚型,是G₁期的主要正性调节因子。他们于G₁期产生,与周期蛋白依赖性激酶(CDK)4/CDK₆结合形成全酶复合物,使pRb(Rb基因的蛋白产物)磷酸化,从而启动转录。 周期蛋白D的表达可以解除Rb所介导的生长抑制作用,与周期蛋白D的促增殖作用相对应的是在多种恶性肿瘤中检测到其过度表达。

　　鉴于对周期蛋白D₁的研究显示其表达异常的机制不止一种,但最终都导致蛋白水平表达增高^［3］ 。因此我们采用免疫组化方法直接检测其蛋白的表达。

　　30例小儿ALL中周期蛋白D₁和D₂过度表达的阳性率分别为7%和0,而周期蛋白D₃阳性率为47%。实验结果提示周期蛋白D₃过度表达与小儿ALL发病有关。

　　通过进一步对周期蛋白D₃过度表达与小儿ALL临床特征的分析,我们发现在WBC≥25×10⁹/L组患儿中周期蛋白D₃过度表达阳性率明显高于WBC＜25×10⁹/L组患儿,提示周期蛋白D₃过度表达可能有促进白血病细胞的增殖的作用。小儿ALL是儿童时期最常见的恶性肿瘤,近年来由于强化疗的使用,使一些高危病人的预后明显得到改善,因此正确判断高危型对指导化疗方案有重要意义。实验结果显示，周期蛋白D₃过度表达与白细胞计数和临床分型明显相关,与年龄的相关性也值得注意,而与浸润体征和免疫分型无相关性。WBC≥25×10⁹/L、年龄≥10岁、临床分型高危型都是小儿ALL的高危因素。而本研究也提示周期蛋白D₃过度表达可能是小儿ALL的一个高危因素。周期蛋白D₃在小儿ALL发生中的具体作用机制及其是否可以作为独立的预后指标尚需做大量实验及随访观察才有可能被阐明。进一步揭示其作用机制有助于深入探究白血病的发生,并为白血病的基因治疗提供新的靶点。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39700150）

　　参考文献

　　［1］Motokura T, Arnold A. Cyclins and oncogenesis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1155:63-78.

　　［2］Van Diest PJ, Michalides R, Jannind I, et al. Cyclin D₁ expression in invasive breast cancer correlations and prognostic value. Am J Pathol, 1997, 150:705-711.

　　［3］Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer Ⅱ: cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell, 1994, 79:573-582.

收稿日期：1999-02-22