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儿童急性白血病多药耐药基因检测的临床价值

儿童急性白血病多药耐药基因检测的临床价值

中华儿科杂志 2000年第5期第38卷 论著摘要

作者:周东风 孟浦 李立家 金润铭 费洪宝

单位:周东风(430022 武汉,同济医科大学附属协和医院儿科);孟浦(430022 武汉,同济医科大学附属协和医院儿科);金润铭(430022 武汉,同济医科大学附属协和医院儿科);费洪宝(430022 武汉,同济医科大学附属协和医院儿科);李立家(武汉大学生命科学院遗传研究室)

  随着联合化疗的应用,儿童急性白血病的疗效已有极大提高,但仍有部分患儿达不到完全缓解或缓解后易复发。多年的研究发现,白血病细胞多药耐药性 (multidrug resistance, MDR)是白血病难以获得良好疗效的障碍。多药耐药基因(mdr1)的扩增和过度表达所引起的MDR是其中的一个重要机制[1]。我们以半定量逆转录聚合酶链反应 (reverse transcription polymerase reaction, RT-PCR)技术检测了33例儿童急性白血病细胞中mdr1 mRNA基因的表达,初步探讨了其与临床耐药的关系。

  对象

  小儿急性白血病 33例均符合 FAB的诊断标准。33例患儿共检测骨髓标本58份,其中 23份为初治时留取的骨髓,27份为诱导缓解后留取的骨髓,另8份难治性复发患儿于诱导化疗4个疗程后或复发时留取的骨髓。10例正常小儿的外周血作为对照。

  方法

  1.细胞总RNA提取:按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。

  2.逆转录 RNA合成 cDNA:30 μl反应体系中含RNA 1 μg, 3 μg随机引物和200 U 的MMLV(小鼠白血病病毒)逆转录酶,于42℃水浴反应1 h。

  3.PCR 反应:50 μl反应体系含10 μl 的 5×buffer,2 μl 的 0.25 mmol/L dNTPs。mdr1和β2M引物各 50 pmol,逆转录产物 cDNA 150 ng,Taq酶 1 U混匀。94℃变性 40 s,50℃退火 50 s,72℃延伸 70 s,循环扩增30个周期,最后1次延伸时间为10 min。mdr1引物序列为5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG(2596-2615),3′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-5′, 扩增片段为 157 bp。为消除实验误差设β2M mRNA为 mdr1 mRNA检测的内标,序列为5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ (1543-1562),3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-5′,扩增片段为114 bp[2]

  4.mdr1 基因半定量:以 pBR322 DNA/MspI作为 DNA分子量标记,取10 μl电泳产物于2%琼脂糖凝胶上70 V电泳1 h,置紫外检测仪上观察、照相。底片置激光密度扫描仪上定量。计算mdr1/β2M比值来表示mdr1 的表达水平。统计学处理采用χ2和t检验。

  结果

  1.mdr1基因RT-PCR结果:10例正常小儿外周血对照标本未见mdr1基因扩增带,仅见一条β2M基因扩增带。Mdr1基因阳性表达患儿则可见强弱不等的mdr1和β2M基因2条扩增带 。

  2.33例患儿mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值结果:复发难治组患儿的mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值明显高于初治组和诱导缓解组,差异有非常显著意义(表1)。

  3.mdr1基因表达与临床的关系:23份初治患儿有4例mdr1阳性,其中2份经诱导化疗不缓解,余19份 mdr1阴性患儿仅1例不缓解,缓解率达95% 。27份诱导化疗缓解后的患儿有8例mdr1表达阳性,其中5份患儿逐渐复发,mdr1基因表达更加增强。复发难治组仅1份mdr1表达阴性,余7份患儿mdr1基因持续表达,化疗效果差,缓解率低。仅有1份mdr1阳性表达患儿在更换化疗方案后再次获得缓解。

表1 33例白血病58份骨髓标本mdr1

  表达结果及比较(±s)

组别 份数 mdr1阳性份数(%) mdr1/β2M
①初治患儿组 23 4(17) 0.34±0.11
②诱导缓解组 27 8(30) 0.36±0.15
③复发难治组  8 7(88) 0.78±0.21

  注:三组mdr1表达阳性率比较:①与②比较:χ2=1.019 9,P>0.5;①与③比较:χ2=12.743 8,P<0.005;②与③比较:χ2=8.439 4,P<0.005;三组mdr1/β2M值比较:①与②比较:t=0.499 2,P>0.5;①与③比较:t=5.5 821,P<0.001;②与③比较:t=5.529 9,P<0.001  讨论

  本研究对 33 例急性白血病患儿化疗前后及复发前后进行了短期动态检测,发现急性白血病患儿初治时即可检测出mdr1基因表达。这种原发性mdr1基因表达,有认为可能是在转化为急性白血病过程中的基因突变所致[3,4],是导致部分患儿不能获得缓解的主要原因。在对诱导缓解组患儿的随访检测时发现5例逐渐复发的患儿其 mdr1基因表达亦增强,提示在诱导缓解后的巩固治疗中药物产生了MDR。mdr1基因阳性表达患儿其化疗疗效差,易复发,缓解率明显低于mdr1基因阴性患儿。因此,小儿急性白血病的化疗效果及预后与 mdr1基因的表达水平密切相关,mdr1基因表达增加是不良预后的一个重要因素[2]

  然而,1例经常规诱导化疗不缓解的初治mdr1阳性表达患儿和1例复发患儿经加大化疗剂量和更换化疗药物后获得缓解,提示mdr1基因表达增高并非对所有化疗药物耐药,且复发的难治患儿中有1例mdr1基因表达阴性,从而说明mdr1表达差异不能解释所有的临床白血病耐药。但初治患儿mdr1基因阳性表达可作为常规化疗疗效差的一个指标,而且,对确有mdr1基因表达者应选择大剂量化疗作为诱导缓解方案或选用非MDR机制相关药物进行治疗[2-4]

  总之,MDR机制与mdr1基因的表达高度一致,且mdr1基因表达水平的高低与难治程度及复发有关。现已证实, mdr1基因编码产生的P糖蛋白(Pgp)可将细胞内的药物泵出到细胞外,同时还可阻止细胞膜上的药物进入细胞内,从而降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。目前,已有多种药物可以逆转MDR,但逆转剂必须用于那些确由Pgp介导的MDR患儿,因此,检测mdr1基因表达是前提条件。由于mdr1基因表达没有确定的基因突变或重排,临床筛查难以在DNA水平上完成。 半定量RT-PCR技术操作简单,重复性好,且有良好的特异性和敏感性尤适用于低表达标本的检测,对临床选择及修正化疗方案和判断预后具有一定的指导意义,也为逆转剂的应用提供了理论依据。

参考文献

  1,Pirker R, Wallner J, Geissler K,et al.MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia.J Natl Cancer Inst,1991,183:708-712.

  2,Noonan KE, Beck C,Holzmayer TA,et al. Quantitation analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160-7164.

  3,Sato H,Preisler H,Day R,et al. MDR1 transcript levels as an indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia. Br J Haematol, 1990,75:340-345.

  4,Haber DA. Multidrug resistance(MDR1) in leukemia: is time to test? Blood,1992,79:295-298.

(收稿日期:1999-07-08)


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