可移植性BALB/c小鼠红白血病模型的建立及其生物学特性

中华血液学杂志 1998年第12期第19卷 论　　著

作者：丁顺利　褚建新　赵钧铭　褚雁　姜露　应红光

单位：300020　天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所,实验血液学国家重点实验室

　　关键词： 小鼠，近交BALB/c；白血病，小鼠；7,12-二甲基苯蒽；模型，白血病

　　摘要　目的:利用7,12-二甲基苯蒽诱发的BALB/c小鼠红白血病,通过在同基因小鼠中连续移植建立一株可移植性BALB/c小鼠红白血病模型,并对其主要生物学特性进行研究。方法:用红白血病小鼠脾细胞给同基因型小鼠连续传代,经20代的连续传代,发病率100％,无自发缓解。结果：静脉接种的瘤细胞数量与存活时间呈线性关系,接种10⁶白血病细胞平均生存期为10.2±1.3天;瘤细胞主要侵及骨髓、脾及肝脏,一般不累及淋巴结和胸腺;晚期外周血出现大量瘤细胞,以早幼和中幼红细胞为主,晚期网织红细胞和血小板减少;血红蛋白染色呈阳性或弱阳性,过氧化物酶反应阴性,Thy-1抗原、Fc受体阴性;电镜观察未见病毒样颗粒;对临床常用化疗药物反应敏感。结论:可移植性BALB/c小鼠红白血病模型的建立为研究红系增生和分化、非病毒性红系恶性疾病的发病学和实验治疗等提供了较为理想的动物模型。

　　Establishment and biological characterization of a transplantable BALB/c mouse erythroblastic leukemia model 　Ding Shunli, Chu Jianxin,Zhao junming, et al. State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of hematology, CAMS and PUMC, Tianjin　300020

　　 Abstract　Objective:Biological characterization of a bALB/c mouse transplantable erythroblastic leukemia model EL9611. methods and Results: The original erythroblastic leukemia (EL) mouse was obtained by 7,12-DMBA induction. The spleen cell suspension from the original EL mouse was injected into the same inbred BALB/c strain mice. After successive transplantation for 20 generations,the incidence of EL was 100％without spontaneous remission. There was a linear relationship between the survival time of the EL mice and the number of leukemic cells inoculated. When 10⁶leukemic cells were inoculated intravenously, the EL mice survived 10.2±1.3 days. invasion of leukemic cells involved mainly in the bone marrow,the spleen and the liver. There was no obvious infiltration of leukemic cells in lymph-nodes and thymus.In peripheral blood, there were a large number of leukemic cells and most of them were basophilic or polychromatophilic erythroblasts. At the advanced stage,the mice developed anemia and thrombocytopenia. The reaction of the leukemic cells for hemoglobin staining was positive or weakly positive. While the peroxydase reaction was negative, Thy-1 antigen and Fc-recepter were not presented. No virus-like particles was found in the cells under electron microscope. EL9611 leukemia model was sensitive to some antitumor drugs used in clinical therapy.Conclusion: The establishment of EL9611 leukemia model offered a useful tool for studying proliferation and differentiation of erythroid cells,as well as pathogenesis and experimental treatment of non-virus erythroid malignancy.

　　Key words　Mice,inbred BALB/c　　Leukemia,mouse　　7,12-DMBA　　Model,leukemia

　　小鼠红白血病是研究红系造血、红系恶性疾病较为理想的模型。国外仅有Friend^［1］和Rauscher^［2］报道的用病毒及 itoh等^［3］用放射线诱发而建立的小鼠红白血病模型。至今,国内外文献中尚未见化学诱发的可移植性小鼠红白血病模型的报道。最近,我们在7,12-二甲基苯蒽(7,12-dimethylbenzan-thracene,7,12-DMBA) 诱发BALB/c小鼠白血病实验中发现一只红白血病小鼠，并成功地在同系小鼠中建立了一株可移植性BALB/c小鼠红白血病模型。现将建立过程及其生物学特性报告如下。

材料和方法

　　1　实验动物　BALB/c小鼠,6～8周龄，体重16～18g,由本所动物室和中国医学科学院实验动物中心提供,均为Ⅱ级。

　　2　7,12-DMBA配制和诱发方法　7,12-DMBA（德国 Fulka）0.5g溶于100ml注射用橄榄油。经口喂服，每只0.2ml（1.0mg），每周1次，连续给药4周。

　　3　移植实验　无菌条件下取发病小鼠脾脏,制备单细胞悬液,分别进行静脉(眼或尾静脉)、腹腔和皮下接种。经静脉接种白血病小鼠脾细胞2×10⁶/只，常规体内传代。

　　4　血象检查　取小鼠尾静脉血,用血细胞计数仪作血常规检测;血涂片行Wright染色,细胞分类计数,网织红细胞于煌焦油蓝染色后计数。

　　5　血红蛋白和过氧化物酶染色　取发病小鼠尾静脉血涂片，以1％二氨基联苯胺行血红蛋白染色;按Washborn氏法行过氧化物酶染色。

　　6　细胞免疫化学染色　取发病小鼠骨髓制成单细胞悬液,以抗小鼠Thy-1单抗和抗小鼠Fc受体单抗为一抗,以荧光标记的兔抗小鼠Ig抗体为二抗(均由北京医科大学免疫系提供）,按常规进行免疫荧光检测。

　　7　染色体检测　用发病明显期小鼠骨髓和脾脏制备细胞悬液，加入0.05μg/ml秋水仙胺，在5%CO₂、37℃条件下孵育2小时后收获细胞，0.085mol/L kCl溶液，37℃低渗处理25分钟，制片，Giemsa染色。

　　8　病理形态学观察　称量发病小鼠体重和肝、脾重量,取骨髓（股骨）、脾、肝、胸腺、肺、心等组织用Bouin液固定,石蜡切片,HE染色,光镜下观察。

　　9　电镜观察　取发病小鼠脾组织,0.5％戊二醛固定,超薄切片,用H-600电镜观察细胞超微结构变化。

　　10　无细胞滤液接种试验　制备发病小鼠脾脏无细胞滤液,静脉接种BALB/c小鼠6只,每只0.5ml,观察发病情况。

　　11　药物敏感试验　静脉接种发病小鼠脾细胞2×10⁶/只,24小时后分组腹腔给药,每天1次，连续6天。记录发病情况和存活时间,按公式计算抑制率:

结　　果

　　1　模型建立　20只BALB/c小鼠(雌雄各半)口服7,12-DMBA诱发白血病实验中,在停药后第13天(首次给药后第34天),1只雄性小鼠发生红白血病,该小鼠肝、脾明显肿大，胸腺、淋巴结未见肿大,外周血涂片出现大量原始和幼稚红细胞。将该鼠活杀,取脾脏制备成单细胞悬液, 给3只同系小鼠静脉接种,结果全部发病;连续传代20代,移植成功率100％,无自发缓解,从而建立了一株化学致癌剂诱发的BALB/c小鼠可移植性红白血病模型(定名EL9611)。

　　2　动物存活时间　统计5～20代共90只小鼠存活时间, 平均为10.2±1.4天,最短9.0天,最长12天,中位数9.5天。不同性别、不同月龄(1.5～5个月)、不同地区(北京和天津)和同一地区不同单位的BALB/c小鼠,其发病及存活时间均无显著性差异。

　　3　不同途径接种小鼠发病情况: 静脉、腹腔、皮下3种途径先后接种BALB/c小鼠102只,发病情况见表1。

表1　不同途径接种EL9611发病情况

　　*另2只观察90天未见发病

　　4　接种不同细胞量与小鼠生存时间的关系　静脉接种发病小鼠脾细胞1×(10²～10⁶),动物存活时间与接种细胞数呈直线关系（附图）。

附图　接种不同瘤细胞数量与生存时间的关系

　　5　外周血象变化　第15代8只小鼠接种后第9天外周血象：WBC(43.9±17.1)×10⁹/L,　RBC(9250±580)×10⁹/L,Ret 0.054±0.004, BPC (309.0±72.8)×10⁹/L, hCT 43%±2％;血涂片有核红细胞约占0.60,其中以早幼和中幼红细胞为主,少数为原始红细胞和晚幼红细胞,并可见病理性核分裂。

　　6　细胞化学和免疫细胞化学反应　血红蛋白染色,中幼和晚幼红细胞呈黄色阳性反应,原始和早幼红细胞呈弱阳性反应。瘤细胞过氧化物酶染色呈阴性反应;Thy-1单抗、Fc受体单抗染色,瘤细胞均为阴性。

　　7　染色体变化　共计数了36个染色体分散较好的中期分裂细胞，38和39条者占66.7%，分别含1条和2条双臂染色体，双臂染色体出现率为80.9%。

　　8　病理形态学和电镜观察　小鼠接种红白血病细胞后,肝、脾逐渐肿大,濒死时肝重为正常的4.6倍,脾重为正常的5.3倍。镜下肝、脾及骨髓有弥漫性白血病细胞浸润,主要为幼稚红细胞,正常组织结构破坏,在骨髓内残留有少量粒系及巨核细胞;淋巴结和胸腺等其他脏器无明显白血病细胞浸润,但脏器血管内有瘤细胞淤滞。脾脏电镜观察,瘤细胞一般呈圆形,表面无明显胞突,胞质内可见较多的线粒体,少量粗面内质网，高尔基体较发达;核呈圆形,可见核仁;并见有核致密的晚幼红细胞;细胞内外未发现病毒样颗粒。

　　9　无细胞滤液接种试验　发病小鼠脾脏无细胞滤液静脉接种6只同基因小鼠,观察3个月无一发病。

　　10　药物敏感性试验　EL9611小鼠对3种常用化疗药物的反应敏感性见表2。

讨　　论

　　7,12-DMBA是一种强致癌剂,可诱发实验动物乳腺癌和白血病等多种肿瘤,在所诱发的大鼠白血病中,红白血病发病率甚高^［4］,我们曾报道一株用7,12-DMBA诱发而建立的TR1大鼠可移植性红白血病模型^［5］,因TR1近交系大鼠在国内尚未推广而限制了该模型的应用。但在小鼠,7,12-DMBA多引起淋巴细胞白血病, 我们曾多次用 7,12-DMBA诱发615近交系小鼠白血病,未遇到过一例红白血病^［6,7］。本实验用7,12-DMBA诱发BALB/c小鼠白血病,于停药后13天发现1只病鼠,肝脾巨大,外周血出现大量原始和幼稚红细胞,诊断为红白血病,以后经病理形态学、细胞化学、免疫组化等方法证实。在此后继续1年的观察中,除发现5例胸腺瘤型白血病及4例实体瘤(包括乳腺癌、前胃癌和皮肤癌)外,未再见红白血病发生,可见小鼠与大鼠不同,发生红白血病甚为罕见。通过原代红白血病小鼠脾脏细胞在同基因型小鼠中连续20代传代,成功地建立了一株可移植性BALB/c小鼠红白血病模型;连续传代后,发病小鼠的血象及细胞形态学、细胞化学特点基本上保持原代红白血病的特点,仅晚幼红细胞有所减少。

表2　小鼠白血病EL9611对化疗药物的反应

　　每组鼠数为8只

　　该模型的主要生物学特性：①接种红白血病细胞后,外周血白细胞逐渐增高,白血病细胞以原始和幼稚红细胞为主,晚期网织红细胞和血小板减少;②白血病细胞脏器浸润主要定位于肝、脾和骨髓,很少累及淋巴结和胸腺；③电镜观察未发现病毒样颗粒,无细胞滤液接种不致病,提示其发病与病毒无关;④静脉接种1×10²白血病细胞即可100%发病,小鼠生存时间与接种瘤细胞数量呈线性关系,但腹腔和皮下接种发病时间延长且不规律,这可能与该细胞的侵袭能力弱有关。由此可见,EL9611小鼠白血病是一株较分化的红系恶性疾病。

　　目前, 人们对病毒，特别是Friend小鼠白血病病毒(F-MuLV)诱发的红白血病已有了广泛而深入的研究,用Friend病毒诱发的白血病小鼠脾细胞或无细胞提取液均可致病,电镜下在瘤细胞表面和瘤细胞间可见大量C病毒颗粒^［8］;但在人类白血病中,除成人T淋巴细胞白血病与病毒(HTLV)有关外,绝大部分白血病尚未发现与病毒有关。 itoh等^［3］用放射线诱发 C3H小鼠而建立的可移植性红白血病,需静脉接种1×10⁷白血病细胞才能发病,文献中有关该模型的应用情况报道甚少。EL9611小鼠红白血病模型的建立,为研究红系增殖、分化,以及非病毒性红系恶性转化的机制和实验治疗提供了十分有用的工具;此外,BALB/c小鼠已在国内外各实验室普遍使用,因而更有利该模型的推广使用和与国外进行合作和交流。

　　从本实验观察的临床常用的3种化疗药物的初步结果来看,在相同给药方案情况下,EL9611小鼠白血病对阿糖胞苷和高三尖杉酯碱的敏感性明显高于L615小鼠白血病,而对环磷酰胺的敏感性稍低于L615小鼠白血病^［8］。此外,红系造血细胞血红蛋白的表达是一独特的细胞分化指征,因此，它还可用于瘤细胞诱导分化的研究。

参 考 文 献

　　1　Friend C. Cell-free transmission in adult Swiss mice of a disease having the character of leukemia. J Exp Med， 1957, 105：307-318.

　　2　Rauscher FJ. A virus-induced disease of mice characterized by erythrocytopoiesis and lymphoid leukemia. J Natn Cancer Inst， 1962, 29：515-543.

　　3　Itoh K,Ono K,Swada H,et al. Establishment and characterization of a transplantable erythroblastic leukemia in C3H. Leukemia Res， 1988, 12：471-478.

　　4　Zeller WJ. Chemotherapy of autochthonous leukemia induced by7,12-dimethylbenz(a)anthracene in Long Evans Rats. Cancer Res Clin oncol,1980,96:157-160.

　　5　褚建新, 应红光,赵堂富，等.可移植性大鼠红白血病模型的建立.中华血液学杂志,1989,10:297.

　　6　褚建新,丁立,应红光.二甲基苯蒽诱发615近交系小鼠白血病早期病理改变的研究.中国病理生理杂志, 1989,5:435-438.

　　7　彭勤兴，褚建新.化学诱发小鼠白血病的病理类型、免疫表型及移植生物学特性的研究.中国病理生理杂志,1994; 10: 574-577.

　　8　褚建新,华国勋,丁立，等. Friend病毒诱发小鼠红白血病生物学的进一步研究.北京实验动物科学, 1993, 10:11-14.

　　9　中国医学科学院药物研究所药理室. 可移植性小鼠白血病(L615) 实验研究Ⅴ：L615在筛选抗癌药物中的应用. 遗传学报,1975,2:284-287.

(收稿：1998-02-11　　修回：1998-05-12)

(校对：张吉贤)